番茄花粉发育时期与花蕾大小关系的研究

高 慧， 李 昂， 陈双越， 齐海军， 杨 阳， 金东淳*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉农业有限公司，吉林 长春 130000)

番茄花粉发育时期与花蕾大小关系的研究

高 慧1， 李 昂1， 陈双越1， 齐海军1， 杨 阳2， 金东淳1*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉农业有限公司，吉林 长春 130000)

以“贼不偷”番茄品种为材料，采用DAPI染色方法研究了番茄花粉发育时期与花蕾长度的关系。结果表明：同一朵花的不同花药中花粉粒的发育时期基本一致,并且番茄花的长度与花粉粒的发育时期也有着较严格的对应关系。当花蕾长度小于0.4 cm时，花粉基本处于小孢子母细胞时期；长度为0.4～0.6 cm时，为花粉发育的二分体时期；长度为0.6～0.7 cm时,为四分体时期；长度为0.7～0.8 cm时，为单核居中期；长度为0.8～0.9 cm时，为单核靠边期；长度为0.9～1.1 cm时，为二核花粉期；长度大于1.1 cm时，基本为成熟的小孢子。

番茄；花蕾长度；花粉粒；发育时期

植物花药培养中，花粉的发育时期是影响花药(花粉)培养效果的重要因子之一[1-11]。很多花药培养研究结果表明，不同发育时期的花粉粒对花粉培养的效果有很大差异，选择适宜发育时期的花粉粒是决定花粉培养成败的关键，一般认为单核中期或单核靠边期是花粉培养的最佳时期。而花粉培养需从许多花或花药当中取花粉粒，对每一朵花或花药进行镜检并确定其花粉发育时期既费时费力，又会对小孢子活力造成一定的损伤。所以针对某一植物进行花粉培养时接到一些能够准确判断其花粉发育时期形态等标记是非常有必要的。植物中有许多关于花(或花蕾)长度与花粉发育时期关系的相关研究，表明花(或花蕾)的长度与花粉发育阶段存在密切关系[12-13]。关于番茄曾有过花粉发育时期与花药培养效应的研究[14]，但尚无花粉发育时期与花粉培养的相关研究。本试验筛选出对花粉培养响应较好的、适合番茄花粉培养的“贼不偷”番茄品种为试验材料，着重研究小孢子各发育时期的细胞学特征以及不同发育时期与花蕾大小的相关性，以便直接从花(或花蕾)的长度来推断小孢子的发育时期，为番茄花药或小孢子培养提供简单易行的小孢子发育时期鉴定方法。对进一步优化花粉培养条件及提高胚状体的诱导效率、以及建立番茄花粉培养体系等诸方面也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

从市场购买“贼不偷”番茄品种的种子，育苗后移栽至温室大棚栽培，在盛花期采集新鲜的、不同长度的花蕾为材料。

1.2 方法

采摘生长健壮的第1花序中的花,从花蕾基部到顶部测量长度,并根据花的大小分为7种不同长度:A(0～4 mm)，B(4～6 mm),C(6～7 mm),D(7～8 mm),E(8～9 mm),F(9～11 mm ),G(11 mm以上)(图1)。取不同长度的花蕾(各5个)，分离花药(一朵花蕾中通常有5～6个花药)，于卡诺固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h。取出后,用柠檬酸/磷酸缓冲液(pH值为4)中和固定2 h。用镊子取出花药并用解剖刀切开,轻轻压片。先在载玻片上滴1滴2 mg/L(2 mgDAPI溶于1 L蒸馏水)的DAPI染色液,置花药于此液体中进行简易压片,置于黑暗中10 min。用Olympus落射式荧光显微镜，分别在10×10、10×20、10×40(目镜×物镜)倍镜下，每片观察3个视野确定花药小孢子的发育时期并照相。其中，荧光激发光λ=358 nm[15]。

注：A(0～4 mm)、B(4～6 mm)、C(6～7 mm)、D(7～8 mm)、E(8～9 mm)、F(9～11 mm)、G(11 mm 以上)

图1 “贼不偷”番茄品种不同发育时期花蕾的外观形态

Fig.1 The exterior forms in different development periods of buds in “zeibutou” tomato

2 结果与分析

通过对不同大小番茄花蕾花粉发育的显微观察，发现番茄花蕾的大小与小孢子发育时期有一定的关系。根据不同时期花粉的形态特征，番茄花粉粒的发育可分为小孢子母细胞时期、二分体时期、四分体时期、单核居中期和单核靠边期、二核花粉期、成熟小孢子等7个阶段。

该试验主要采用DAPI荧光染色剂对番茄不同发育时期的细胞进行观察，而没有选用植物花粉研究中最常用的醋酸洋红染色剂，主要是因其特异性差，在清晰观察花粉细胞核的动态变化中存在局限性。DAPI是能够与核物质(DNA)特异性结合的荧光染料，是观察、研究细胞核动态变化的理想染色剂，已广泛地应用于细胞分子生物学等各个领域, 其中较多地应用于动物癌细胞、胚胎细胞以及植物染色体带型、异染色质等研究[16-17]。但它在检测花粉粒发育时期的应用报道较少, 有关检测番茄花粉粒发育的文献就更少，这主要是由于厚而坚硬的花粉壁阻碍染色剂的渗透。该试验通过有效的固定以及中和固定等前处理, 在保证维持花粉粒正常形态的同时,有效地软化花粉壁,使 DAPI 能够渗透进入到花粉粒中, 并准确、清晰地观察到了花粉母细胞、四分体、单核花粉粒和二核花粉粒等不同发育时期细胞核的动态变化。这一染色方法也为番茄游离小孢子培养以及胚状体发育过程的动态变化研究奠定了坚实的基础。

2.1 番茄花粉发育特性

番茄小孢子的形成和花粉粒的发育与黄瓜[18]、辣椒[19]花粉粒的发育相似。在小孢子母细胞时期，细胞核大，无明显的液泡，表现为细胞着色较深，在小孢子母细胞的四周沉积1层胼胝质物质。小孢子母细胞第1次减数分裂后产生分隔壁，将母细胞分为2个子细胞，即二分体，2个核同步进行第2次分裂，分裂后在4个核之间产生细胞壁形成四面体型的四分体和两侧对称型四分体。制片观察到四分体四周的胼胝质壁并非完全规则地包裹着四分体。包裹在四分体四周的胼胝质被分解后，小孢子从中游离出来彼此分开，小孢子释放出来,此时在花粉壁上可观察到3个呈凸透镜形状的萌发孔。刚游离出来的小孢子细胞质浓厚，细胞核位居中央，此期为单核中期，细胞质内液泡不明显，细胞壁呈收缩状态为小孢子收缩期。随着小孢子从四周汲取养料，细胞体积逐渐增大，液泡逐渐发育为大液泡，并将细胞核挤到边上，此期为单核靠边期。而后细胞质逐渐充满整个细胞，细胞核进行1次不均等有丝分裂，形成双核，靠花粉壁的为生殖细胞，占据细胞中央的为营养细胞。番茄成熟的花粉粒为二细胞花粉粒，在花粉壁上可观察到明显的3个呈凹透镜形状的萌发孔,这与朱丽萍[20]的结果基本相似。

2.2 番茄花粉发育时期与花蕾大小的关系

按花蕾大小观察每个等级番茄花蕾的花粉粒发育特性，结果表明：花蕾小于0.4 cm时，花粉粒处在花粉母细胞减数分裂期(图2-A)，此期可观察到番茄(2n=2x=24)有12对染色体(图2-B)。花蕾大小为0.4～0.6 cm 时，花粉母细胞均等的分裂成2个子细胞，此期为花粉粒二分体时期(图2-C,D)。花蕾大小为0.6～0.7 cm时，花粉粒处在四分体时期(图2-E,F)。这一时期的花蕾中可以观察到被胼胝质包围的单核的四分体。花蕾大小为0.7～0.9 cm时，花粉粒处在单核花粉期。荧光显微镜下可观察到从四分体四周胼胝质分解后游离出来的核位居中央的小孢子，此期为花粉粒单核居中期(图2-G,H)。随着花粉粒的不断发育膨大，可观察到小孢子中的大液泡把细胞核挤到一边，此期为花粉粒单核靠边期(图2-I)。花蕾大小为0.9～1.1 cm时，荧光显微镜下可观察到2个大小不一、亮度不同的细胞核。由于有丝不均等分裂，形成的细胞核一个大一个小。体积大的为营养细胞核(V)，核大，颜色较浅；体积小的为生殖细胞核(G)，核小，颜色较亮；此时期为花粉粒二核花粉期(图2-J)。花蕾大小为1.1 cm以上时，番茄花粉粒趋于成熟，属发育后期。此时期用油镜(10×100)能明显观察到3个呈凹透镜形状的萌发孔(图2-K,L)。

3 讨论与结论

很多相关植物游离小孢子的研究结果一致认为，很多因素影响单倍体的诱导效果，如基因型、花粉发育时期、胁迫处理、激素、培养基及培养条件等。其中，选择适当的花粉发育时期是能否成功诱导单倍体的前提与关键，普遍认为单核靠边期是花粉培养的最佳时期。而对每一朵花粉粒都鉴定其发育时期，不仅耗时耗力，又损伤花粉粒。为此本文探讨了“贼不偷”番茄品种花蕾大小与花粉发育时期间的关系。以期能够直接从花(或花蕾)的长度来推断小孢子的发育时期，为番茄花药或小孢子培养提供简单易行的小孢子发育时期鉴定方法，从而提高花粉或花药培养的诱导率。

“贼不偷”番茄品种是我实验室筛选出的、对花粉培养响应较好的、适合番茄花粉培养相关研究的好材料，在预备试验中曾诱导出较高频率的胚状体(相关结果将在后续论文中发表)。结果表明，“贼不偷”番茄品种的花蕾长度小于0.4 cm时，花粉基本处于小孢子母细胞时期；长度为0.4～0.6 cm时，为二分体时期；长度为0.6～0.7 cm时,为四分体时期；长度为0.7～0.8 cm时，为单核居中期；长度为0.8～0.9 cm时，为单核靠边期；长度为0.9～1.1 cm时，为二核花粉期；当长度大于1.1 cm时，基本为成熟的小孢子。花蕾大小与花粉发育时期间存在高度相关性。这一结果为本实验室正在进行的番茄花粉离体培养研究提供了重要的参考。

目前，在拟南芥、水稻、油菜等模式植物中已建立了成熟的花粉培养体系。而番茄的单倍体诱导研究多集中在花药培养，吴志苹[21]曾通过番茄小孢子离体培养获得胚状体，但至今尚无相关通过游离小孢子培养获得番茄单倍体植株的报道，这有待我们进一步的研究。植物单倍体的诱导主要采用花药和花粉培养方法，而通过游离小孢子培养诱导单倍体的方法有着可排除单倍体诱导过程中其他体细胞的干扰、可获得大量的单倍体等很多优势。通过植物花粉培养可在短时间内获得大量的纯合的双单倍体(HD)来加快育种进程，同时也在构建遗传图谱群体以及植物细胞全能性研究等很多理论性研究中有着广泛的应用前景。

A,B为小孢子母细胞时期；C,D为花粉粒二分体时期；E,F为花粉粒四分体时期；G,H为花粉粒单核居中期；I为花粉粒单核靠边期；J为花粉粒二核期；K,L为成熟的小孢子。A～J倍率为10×40(Bar=15 μm);K,L倍率为10×100(Bar=18 μm)。

图2 番茄“贼不偷”不同发育时期细胞学观察结果

Fig.2 The results of cytology observation in different development periods of “zeibutou” of tomato

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Studies on the relationship between bud size and pollen development stage in tomato

GAO Hui1, LI Ang1, CHEN Shuangyue1, QI Haijun1, YANG Yang2, JIN Dongchun1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.ZhongyuagricultureCo.,Ltd.ofJilin,ChangchunJilin130000,China)

In present study, the buds with different sizes of tomato variety of “zeibutou” as material, the relationship between bud length and pollen development stage were investigated using DAPI staining method. The results showed that the pollens in different anthers of the same flower were at the identical pollen development stage and, the bud length was strictly corresponding to the pollen development stage. When the bud was shorter than 0.4 cm, most of the pollens were at the microsporocyte stage; the buds were from 0.4 to 0.6 cm, the pollens were at the dispore stage; the buds were 0.6 to 0.7 cm, the pollens were at the trispore stage. When the buds were 0.7 to 0.8 cm, the pollens were at the early uninuclear stage; the buds were 0.8 to 0.9 cm, the pollens were at the late uninuclear stage; the buds were 0.9 to 1.1 cm, the pollens were at the binuclear stage. When the bud was greater than 1.1 cm, the pollens were at the mature microspore stage.

tomato; bud length; pollen; development stage

2016-10-21 基金项目：国际合作研究项目(延边大学—韩国农村振兴厅国立园艺特作研究院)

高慧(1992—),女，山西大同人，在读硕士，研究方向为植物花粉发育机理研究。金东淳为通信作者，

E-mail:jdc1200@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0346-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.012

S641.2

A