大鼠中抗凝血化合物TI-02的含量测定研究*

梁可槿，梁灿恒，利婉红，郑伟涛，周 欣

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)



大鼠中抗凝血化合物TI-02的含量测定研究*

梁可槿，梁灿恒，利婉红，郑伟涛，周 欣

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

对一类肽化合物的抗凝活性进行初步筛选，同时建立测定大鼠血浆中化合物TI-02浓度的HPLC方法。选用C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，采用甲醇-乙腈-水三元体系梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长240 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。抗凝血化合物TI-02在浓度0.125～10.0 μg/mL范围内线性良好，r=0.9964；回收率为97.1%～106.7%；日内、日间精密度RSD < 2.3%，室温24 h内稳定，RSD < 1.0%。本实验建立HPLC测定方法灵敏度高、精密度好，结果稳定可靠，可用于该肽类化合物大鼠血浆中浓度的测定。

肽类化合物；抗凝活性；含量测定

世界上心脑血管疾病的死亡率一直居于第二位，其中血栓栓塞是造成心脑血管疾病发病和死亡的主要原因[1-3]，近十年来研究开发人工合成新型口服直接凝血酶抑制剂是抗血栓药物研究的热点，但取得的成果有限，到目前为止仅上市了阿加曲班和达比加群酯[4-5]，这类药物都是针对单个有活性的凝血因子，抗凝作用不依赖于抗凝血酶，口服起效快，相对于华法林半衰期较短，具有良好的剂效关系，与食物和药物之间很少相互作用，口服使用无需监测常规凝血指标，可以减少或者尽量避免因用药不当造成的药物疗效下降或者出血不良事件，且剂量个体差异小只需固定剂量服用，对医生及患者均极为方便[6-8]。但是这类药物的缺点是口服利用度较低[9]，因此基于凝血酶的相关活性位点自主设计合成的SIPI-GYEZ-TI系列新化合物，有望获得选择性高、活性强、而且口服生物利用度比较好的终产物。通过选取SIPI-GYEZ-TI系列化合物其中一类新颖的肽化合物，并对一定数量的肽类化合物进行小鼠的抗凝血实验，初步筛选出抗凝活性最好的化合物TI-02[10]，而后建立HPLC测定大鼠血浆中该化合物浓度的方法[11-12]，为后续更多化合物血药浓度测定提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

肽类抗凝血化合物(经测定含量均在98%以上)，自主合成；甲醇、乙腈(色谱纯)，Merck公司；纯净水，屈臣氏公司；其他试剂均为分析纯。清洁级SD大鼠，雄性，体重(250±20)g，购于广东药科大学动物中心。

1.2 仪器

1200series高效液相色谱仪，德国安捷伦；AUY120万分之一电子天平，SHIMADZU；G2170BA高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；DZF-6050真空干燥箱，上海博迅实业有限公司；DL-360超声震荡机，宁波石浦海天电子仪器厂。

2 方法与结果

2.1 肽类抗凝血化合物的活性初筛

实验前期合成8个肽类系列化合物(表1)，其母核结构中的苯甲脒基为抗凝活性结构，随着取代基R1的不同化合物的抗凝血IC50也不同，其中TI-02的IC50值是最低，说明可能该化合物的抗凝血活性较强。

表1 肽类TI系各化合物的结构和抗凝血IC50值

为了进一步比较8个化合物的抗凝血活性，采用玻片法，以0.5%低分子肝素钠作对照，以生理盐水为空白，进行小鼠的抗凝血测定，以30 mg/kg的剂量对小鼠腹腔注射，10 min后从眼底静脉丛取血，滴于玻片上(用生理盐水清洗，并晾干)，每隔30 s用针进行挑丝，进行凝血时间测定，汇总实验结果，计算各组凝血时间平均数(表2)。结果显示，化合物TI-02的平均凝血时间最长，为57.2 min，结合IC50的实验结果，说明其抗凝血活性在该8个肽类化合物中的抗凝活性最强，因此本实验选用TI-02进行大鼠血浆中浓度的测定。

表2 肽类化合物的抗凝血活性结果

2.2 色谱条件

色谱柱为DiamonsilTM钻石C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，流动相比例见表3，检测波长240 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。

表3 流动相比例

2.3 溶液的制备

TI-02标准溶液：精密称取化合物TI-02 0.002 g，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度(100 μg/mL)，4 ℃保存备用。

血浆供试品：精密量取TI-02标准溶液10 μL，与空白血浆90 μL混匀，加入乙腈500 μL，10000 r/min离心5 min，取上清液真空浓缩，残渣加100 μL的流动相溶解，涡旋10000 r/min离心5 min，取上清液进样，得到浓度为10 μg/mL的血浆供试品。

空白血浆：精密量取空白血浆100 μL，照供试品处理方法制得空白血浆样品。

2.4 方法专属性

分别取标准TI-02标准溶液、大鼠血浆供试品以及大鼠空白血浆，按“2.2”项下色谱条件测定，结果见图1。TI-02标准溶液的保留时间为9.663 min，拖尾因子为0.88，理论塔板数不低于6000；血浆样品中的内源性物质和代谢产物不干扰TI-02测定。

图1 大鼠血浆中TI-02 的HPLC色谱图

2.5 标准曲线

精密量取TI-02标准溶液，制备浓度为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL系列标准溶液，分别移取5 μL，与空白血浆95 μL混合，混匀1 min，得到浓度分别为0.125、0.250、0.500、1.00、2.50、5.00、10.0 μg/mL的TI-02标准系列血浆样品。同法测定，以TI-02峰面积(A)为纵坐标，TI-02浓度(c)为横坐标，得回归方程y=32.01x+1.3821，r=0.9964，表明血浆中TI-02在0.125～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。定量下限为0.125 μg/mL。

2.6 精密度试验

取高、中、低三个浓度0.125、1.00、10.0 μg/mL的质控样品，同一天连续进样5次，计算TI-02的日内精密度；同一样品连续5天进样，计算日间精密度，结果见表4，RSD不超过2.3%，表明精密度良好。

表4 精密度试验

2.7 回收率试验

方法回收率：配制TI-02浓度为0.125、1.00、10.0 μg/mL的血浆样品各5份，按“2.2”项下色谱条件下进行测定，高、中、低三个浓度样品的方法回收率分别为102.9%±2.14%、98.6%±1.46%、104.5%±2.18%。

绝对回收率：配制TI-02浓度为0.125、1.00、10.0 μg/mL的血浆样品和标准样品，各5份。相同色谱条件下测定，高、中、低三个浓度样品的绝对回收率分别为52.4%±1.69%、57.4%±0.71%、76.5%±1.09%。

2.8 稳定性试验

2.8.1 对照品溶液的稳定性

取对照品储备液，加流动相稀释成0.125，1.00，10.0 μg/mL的对照品溶液，室温下放置，于0，4，8，12，18，24 h各测定1次，3个浓度样品的测定值RSD分别为1.0%，1.0%，0.9%，结果表明，对照品溶液在室温放置24 h是稳定的。

2.8.2 血浆样品日内的稳定性

配制TI-02浓度为0.125，1.00，10.0 μg/mL的血浆样品，处理后的样品于室温下放置，于0，4，8，12，18，24 h各测定1次，3个浓度样品测定值的RSD分别为1.8%，1.0%，0.6%，结果表明大鼠血浆样品的浓度在室温放置24 h内稳定。

2.8.3 血浆样品日间的稳定性

配制TI-02浓度为0.125，1.00，10.0 μg/mL的血浆样品，处理后的样品于4 ℃放置。连续测定6 d。3个浓度血浆样品测定值的RSD分别为3.7%、3.2%、2.7%、2.5%、3.0%、2.6%。结果表明大鼠血浆样品的浓度在4 ℃放置6天内较为稳定。

2.9 血浆样品的采集和处理

雌雄SD大鼠各3只，适应性饲养7 d，实验前禁食12 h，可自由饮水。给药后4 h内禁食、不禁水。单次尾静脉注射TI-02 5 mg/kg，于给药后2，4，6，8，10，20，40，60，120 min于大鼠的眼底静脉丛取血500 μL，4000 r/min离心5 min，分离得到血浆，按“2.3”项下血浆供试品方法处理得到各时间点的大鼠血样。

2.10 单次静注给药后血药浓度

大鼠单次给药后血药浓度的测定结果见表5，以血药浓度均值为纵坐标，取血时间为横坐标，血药浓度-时间的曲线图见图2。

表5 大鼠单次给药后血药浓度的测定结果

图2 大鼠单次给药后的血药浓度-时间的曲线图

3 讨 论

3.1 化合物TI-02的选择

化合物TI系列是SIPI-GYEZ-TI系列中一类具有抗凝血活性的肽类化合物。实验中发现该TI化合物中的抗凝活性普遍比低分子肝素钠高，其中TI-02的抗凝活性尤为突出，小鼠给药后平均凝血时间为52 min左右。所以本实验选择了抗凝血活性最强的化合物TI-02，对其进行HPLC方法测定大鼠体内的血药浓度。

3.2 TI-02溶剂和分离提取方法的选择

比较TI-02在甲醇，乙醇，缓冲盐，水，乙腈，不同pH的溶剂中溶解性发现，在乙腈和水中，溶解性相对较好。考虑到成本、环保及使用的安全性，选择纯净水作为TI-02的溶剂。TI-02的极性较强，如果采用液-液萃取的方法的话，其回收率很低。因此本实验选择了沉淀蛋白法，比较不同有机溶剂沉淀蛋白，乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯分离提取效果皆不理想，乙腈沉淀最好，提取回收率高，而且和血浆蛋白分离比较完全，所以最后选择用乙腈沉淀血浆。

3.3 色谱条件的选择

流动相采用甲醇-水体系时，TI-02和血浆杂质峰的分离效果比较好，但洗脱效果很差。采用乙腈-水体系时，洗脱效果好，但目标锋和杂质峰会重叠，调整乙腈和水比例后，两峰的分离度仍无法达到要求。尝试采用三元流动相体系，结合上述两种体系各自的优势，最终找到以0～5.5 min水-甲醇(84:16)，5.5～12 min水-乙腈(81:19)，12～20 min水-甲醇(84:16)的流动相体系使色谱峰达到了最优的分离洗脱效果。

本实验对化合物TI-02在大鼠血浆中的浓度测定建立了HPLC方法，为其他肽类化合物的测定提供参考。在后续的实验中，将对提高肽类化合物静脉注射的药时曲线的血药浓度值进行进一步的摸索，同时对TI-02的口服利用度作进一步的研究，如采取灌胃等方法观察该化合物在大鼠体内的药动学参数和药代途径，为该化合物的的口服性研究提供数据支持。

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Determination of Content of Anticoagulant Compound TI-02 in Rats*

LIANGKe-jin,LIANGCan-heng,LIWan-hong,ZHENGWei-tao,ZHOUXin

(Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

The anticoagulant activity in a class of peptide compounds was preliminary screened, and a HPLC method of determination plasma concentrations of anticoagulant peptides compound TI-02 in rat was established. The separation was performed on a C18chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 10 μm) by a gradient elution using ternary system of methanol-acetonitrile-water, at a flow rate of 1 mL/min, detection wavelength was 240 nm, column temperature was 30 ℃, injection volume was 20 μL. The linear range of the plasma concentration of the compound TI-02 was 0.125～10.0 μg/mL (r=0.9964). The extraction recoveries were 97.1%～106.7%, intra-day precision and inter-day precision RSD was less than 2.3%. The blood samples were stable at room temperature for 24 h, RSD was less than 1.0%. The HPLC determination method has high sensitivity, good precision, stable and reliable results and can be used for determination of the blood concentrations of the peptides commands in rats.

anticoagulant compounds; anticoagulant activity; determination

2015年广东省大学生创新创业训练计划项目(201510573029)。

梁可槿(1993-)，男，专业：药物化学。

周欣(1982-)，女，实验师，从事药物分析研究。

R914 1

A

1001-9677(2016)024-0084-04