丹参酮ⅡA对成骨细胞增殖的影响

叶 茂，郑 勇，刘艳西，陈 明，胡 锋

(湖北科技学院附属第一医院脊柱关节外科，湖北 咸宁 437100)

丹参酮ⅡA对成骨细胞增殖的影响

叶 茂，郑 勇，刘艳西，陈 明，胡 锋

(湖北科技学院附属第一医院脊柱关节外科，湖北 咸宁 437100)

目的 探讨丹参酮ⅡA对成骨细胞增殖的影响，为丹参酮ⅡA治疗骨质疏松提供实验依据。方法 通过体外培养成骨细胞，实验分为四组：对照组、丹参酮ⅡA低剂量组(5 μM)、丹参酮ⅡA中剂量组(10 μM)、丹参酮ⅡA高剂量组(20 μM)。采用分光光度计测量OD值检测成骨细胞的增殖活性；采用二乙醇胺法测定细胞内碱性磷酸酶活性；使用流式细胞仪检测成骨细胞的凋亡率。结果 丹参酮ⅡA中、高剂量组与对照组相比OD值明显增加(P<0.05、P<0.01)，提示其可提高成骨细胞的增殖活性。与对照组相比，丹参酮ⅡA中、高剂量组细胞内碱性磷酸酶活性明显升高(P<0.05)，而凋亡率则明显下降(P<0.05)。结论 参酮ⅡA能促进成骨细胞增殖，其机制可能是通过抑制成骨细胞的凋亡，为其临床上用于骨质疏松的治疗提供实验依据。

丹参酮ⅡA；成骨细胞；增殖；凋亡

骨质疏松症是由于骨密度和骨质量下降，从而造成骨脆性增加和易产生骨折的全身性骨病，其发生机制未明。骨质疏松症是中老年人特别是老年女性最常见的疾病之一，严重影响人们健康和生活质量[1]。同时，随着人们生活水平的提高，心血管疾病也成为中老年人常见的疾病，并且很多心血管疾病患者同时伴有骨质疏松症，但其发生机制尚未明确，也没有很有效的临床治疗药物。

丹参酮ⅡA广泛应用于治疗心血管病，对冠心病、心绞痛、心律过速有显著疗效[2]，但对骨质疏松的作用特别是对成骨细胞增值的影响尚未见报道。我们通过体外培养成骨细胞，观察丹参酮ⅡA对成骨细胞增殖的影响，并探讨其作用机制，为其临床上用于心血管病伴有骨质疏松症的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 细胞：人成骨细胞株(hFOBI.19)由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

丹参酮ⅡA(纯度98%，阿拉丁公司)；DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；碱性磷酸酶试剂盒(Sigma公司)；凋亡试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。其他所用试剂均为分析纯。

1.2 成骨细胞培养 成骨细胞复苏后接种于培养瓶中，加入DMEM/F12培养基和FBS，置于34℃、5% CO2培养箱中进行培养。24h后细胞将会贴壁生长，每隔2d换培养基一次，第8d待细胞长满瓶底后传代，取传4～6代的成骨细胞用于实验。

实验分组：分为对照组、丹参酮ⅡA低剂量组(5 μM)、丹参酮ⅡA中剂量组(10 μM)、丹参酮ⅡA高剂量组(20 μM)。

1.3 检测方法

1.3.1 成骨细胞增殖活性检测 采用CCK-8法进行检测。通过体外培养使骨细胞密度达到2×105个/mL，接种于96孔板，每孔100μL。每孔按1∶9 比例加入CCK-8，采用分光光度计在450 nm波长处检测吸光度值(OD)，即表示成骨细胞的增殖活性。

1.3.2 碱性磷酸酶检测 采用二乙醇胺法测定细胞内碱性磷酸酶活性，具体按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 成骨细胞凋亡检测 通过体外培养使成骨细胞密度达到2×105个/mL，接种于6孔板中，每孔为2 mL。加入400μL的Binding Buffer轻轻重悬细胞后再加入5μL的AnnexinV-FITCA，室温避光孵育15min，600r/min离心6 min，将沉淀细胞用孵育缓冲液洗涤，然后加入10 μLPI染液，避光处理后在冰浴中放置10min，通过流式细胞仪检测成骨细胞的凋亡率。

2 结 果

2.1 丹参酮ⅡA对成骨细胞增殖活性的影响 分光光度法测定显示对照组OD值为(0.574±0.042)，丹参酮ⅡA低、中、高浓度组分别为(0.601±0.054)、(0.685±0.062)、(0.721±0.082)，丹参酮ⅡA中、高浓度组成骨细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.05、P<0.01)，提示而丹参酮ⅡA可增加成骨细胞的增值活性，且剂量越大，效果越强。见图1。

2.2 丹参酮ⅡA对成骨细胞碱性磷酸酶的影响 采用二乙醇胺法测定细胞内碱性磷酸酶活性，结果发现丹参酮ⅡA低、中、高浓度组明显增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性，与对照组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，并且随着丹参酮ⅡA剂量增加，成骨细胞碱性磷酸酶活性逐渐增强。见图2。

图2 丹参酮ⅡA对成骨细胞碱性磷酸酶的影响与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；n=6

2.3 丹参酮ⅡA对成骨细胞凋亡的影响 对照组成骨细胞凋亡率(10.11±0.42)%，丹参酮ⅡA低、中、高浓度组凋亡率分别为(8.27±0.33)%、(7.86±0.38)%、(7.03±0.43)%，丹参酮ⅡA各浓度组成骨细胞凋亡率与对照组相比有明显差异性(P<0.05或P<0.01)。提示丹参酮ⅡA可通过抑制成骨细胞凋亡从而增强其增值活性。见图3。

图3 丹参酮ⅡA对成骨细胞凋亡的影响与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；n=6

3 讨 论

骨质疏松症是中老年人常见的疾病之一，可引起脊柱变形、骨折甚至致残，从而降低患者的生活质量，给个人、家庭和社会带来沉重的经济负担[3]。骨质疏松症发生原因有多种，可由绝经引起，也可由内分泌疾病、结缔组织疾病或血液系统疾病等导致，其中成骨细胞的活性下降在骨质疏松症发生中起核心作用。成骨细胞主要负责骨基质的合成、分泌和矿化，是骨形成过程中最重要的细胞，其功能活跃状态是成骨的关键因素[4]。成骨细胞数量的增加或其功能活跃都能够发挥抗骨质疏松的作用。因此，促进成骨细胞功能活跃或抑制成骨细胞凋亡都可成为治疗骨质疏松症的重要方法。

丹参酮ⅡA是从中药丹参中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，具有抗菌、抗炎、抗凝血、促进伤口愈合等多种药理作用。临床研究发现丹参酮ⅡA可用于治疗心血管相关疾病，其副作用小，效果显著[5]，并且临床还发现很多心血管疾病患者同时伴有骨质疏松症。那么丹参酮ⅡA在用于心血管疾病治疗的同时是否对骨质疏松症也有治疗作用，值得深入研究。

本研究通过体外培养人成骨细胞，并加入不同浓度的丹参酮ⅡA，结果发现，丹参酮ⅡA中、高浓度组可促进成骨细胞的增殖，且剂量越大，效果越强。同时还发现丹参酮ⅡA可增加碱性磷酸酶活性，并且抑制成骨细胞凋亡，有一定的剂量依耐性。综上所述，丹参酮ⅡA能促进成骨细胞增殖、增加碱性磷酸酶活性、抑制其凋亡，有可能用于骨质疏松的预防及治疗。此外，丹参酮ⅡA作为中老年人心血管的常用药，不良反应少、价格便宜，对于心血管疾病伴骨质疏松的患者，有着较为广泛的应用前景。

[1]YUAN Q，ZHANG G，WU J，et al.Clinical evaluation of the polymethylmethacrylate-augmented thoracic and lumbar pedicle screw fixation guided by the three-dimensional navigation for the osteoporosis patients[J].Eur Spine J，2015，24(5):1043

[2]LEE J C，PARK J H，PARK O K，et al.Neuroprotective effects of tanshinone I from Danshen extract in a mouse model of hypoxia-ischemia[J].Anat Cell Biol,2013,46(3):183

[3]GANDOLINI G，MIGLIACCIO S，BEVILACQUA M，et al.Prevent，treat and maintain：a new goal for osteoporosis management in clinical practice[J].Aging Clin Exp Res，2004，16(3):37

[4]HINOI E，TAKARADA T，TSUCHIHASHI Y,et al.A molecular mechanism of pyruvate protection against cytotoxicity of reactive oxygen species in osteoblasts[J].Mol Pharmacol,2006,70(3):925

[5]YU Q，CHEN H，SHENG L，et al.Sodium tanshinone ⅡA sulfonate prolongs the survival of skin allografts by inhibiting inflammatory cell infiltration and T cell proliferation[J].Int Immunopharmacol，2014，22(1):277

Effect of TanshinoneⅡA on the Proliferation of Osteoblasts

YE Mao，ZHENG Yong，LIU Yan-xi，et al

(DepartmentofJointSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100，China)

Objective To investigate the effect of Tanshinone ⅡA on the proliferation of osteoblasts.Methods The osteoblasts were cultured in vitro and divided into four groups: control group，low dose of Tanshinone ⅡA group(5 μM)，middle dose of Tanshinone ⅡA group(10 μM)and high dose of Tanshinone ⅡA group(20 μM).The proliferation activity of osteoblasts was detected with CCK-8 kit.Intracellular alkaline phosphatase activity was determined by two ethanol amine method.Apoptosis rate of osteoblasts was detected by flow cytometry.Results The proliferation activity was significantly increased in middle and high doses of Tanshinone II A groups and there was statistical significance as compared to the control group(P<0.05 orP< 0.01).Compared with the control group,the activity of alkaline phosphatase activity in high dose group was increased(P<0.05)，while the apoptosis rate was decreased(P<0.05).Conclusion Tanshinone II A can promote the proliferation of osteoblasts partly by inhibiting the apoptosis of osteoblasts，which may provide experimental evidence for the treatment of osteoporosis.

Tanshinone ⅡA;Osteoblast;Proliferation;Apoptosis

R965.2

A

2095-4646(2016)06-0461-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.06.0461

2016-08-30)