金黄色葡萄球菌检测方法的研究进展

文/孔祥瑞 王洪柱

（1 黑龙江立高仪器设备有限公司；2 黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司）

金黄色葡萄球菌检测方法的研究进展

文/孔祥瑞1王洪柱2

（1 黑龙江立高仪器设备有限公司；2 黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司）

金黄色葡萄球菌是人体致病菌，被其污染的食品会由于金黄色葡萄球菌代谢的肠毒素导致中毒。因此，在原料乳及乳产品检验中金黄色葡萄球菌是作为一种致病菌污染的指示菌，其检测方法的开发和研究具有重要作用和意义。研究论述了金黄色葡萄球菌国内和国外检测方法的研究进展，旨在为食品生产提供一种快速、方便、准确的检测技术。

金黄色葡萄球菌；检测方法；研究进展

金黄色葡萄球菌是广泛存在于自然界和人体皮肤上的兼性厌氧革兰氏阳性菌。它存在于人体的鼻黏膜、肠道、皮肤等部位，通常不具致病性，但是皮肤化脓感染常见的病原菌[1]。虽然它不具有致病性，但其产生的肠毒素会导致中毒。食品易受其污染，导致人体食物中毒，主要症状是发烧、腹泻和恶心呕吐[2～3]。金黄色葡萄球菌分泌20 多种毒性蛋白质，常见为7 种，可耐高温，100 ℃加热30 min不被破坏，据报道成人仅食用约100 ng肠毒素A，即可导致食物中毒[4]。近几年，我国因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居全世界第4位[5]。为控制金黄色葡萄球菌的污染，应定期检查奶牛乳房，定期检查工作人员健康状况，并且应在低温和通风良好的条件下贮藏生牛乳。金黄色葡萄球菌在乳制品中最常见，因此金黄色葡萄球菌的检测技术十分重要。本文对目前金黄色葡萄球菌的检测方法研究进展进行综述，旨在为从事金黄色葡萄球菌检测鉴定的工作人员提供指导和参考。

1 金黄色葡萄球菌检测的常规方法

食品中金黄色葡萄球菌的国标检测方法大多采用平板计数法，我国食品金黄色葡萄球菌的检测是以GB 4789.10-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》为依据。定性检测前先配制液体培养基进行前增菌，后将混合好的培养物接种到血平板或Baird-Parker平板，当培养终止，观察特征，镜检，通过血浆凝固酶做生化鉴定。定量检测前先将样品稀释，后将样品接种到Baird-Parker平板，培养一定时间，计数典型菌落。金黄色葡萄球菌肠毒素可通用ELISA快速检测试剂盒对A、B、C、D、E 5 种肠毒素型进行检测[6]。

2 快速检测方法

快速检测方法是传统方法的改进，微生物在生长代谢时会产生特异性酶或其它代谢产物，将显色底物加入到选择培养基中，微生物生长时会使其具有特殊颜色，从而分离和鉴别金黄色葡萄球菌。快速检测方法大大缩短了检测时间，并且能够快速得到结果，操作方法相对简单。食源性致病菌的危害是食品安全的一个重要方面。近年来，食源性致病菌污染事件频频发生，食品安全国家标准对不同食品有相关规定，近来国家标准化管理委员会还通过了对食品中致病菌、污染物的限量规定。现有致病菌的检测技术与方法受设备、人员、环境制约，基层人员难以掌握推广，成熟的快速检测技术和方法是未来食源性致病菌检测的发展方向。

2.1 测试片法

测试片法是近年来采用较广泛的方法，是指以胶片、纸片等作为培养载体，将特定的显色物质和营养培养基质附在载体上，通过在其上生长的微生物代谢与显色物反应以测定食品中的微生物含量。其具有操作简便、价格低廉、污染小，无需配制试剂、无需准备大量器皿，少量样品也可测定，易于保存和消毒，方便携带及运输，能真实反映检品中的细菌数等优点，但是其无法准确定性计数。此法现在已应用在快速检测领域中，其中美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。该测试片主要由金黄色葡萄球菌热稳核酸酶片及培养基两部分组成，第一部分是Baird-Parker改良后的培养基，第二部分是利用金黄色葡萄球菌在生长过程中产生的特异性热稳核酸酶，尽管加热到一定温度，然而仍具有活性，能够分解DNA链，之后与底物四唑指示剂、甲苯胺蓝反应，1～3 h后显色，呈现粉红色的圆环菌落，从而鉴定金黄色葡萄球菌。随着国外显色检测技术的成熟，国内也主要对显色培养基进行研究。

2.2 试剂盒法

试剂盒法通常将十多种，甚至几十种培养基或成分集中在特定微型装置内，通过观察微生物的生长和代谢过程的某些产物或现象，对试验现象进行分析，将传统试验中多次试验通过一次完成，缩短了检测时间。此法可大大缩短测试时间，在24 h内得出结果，甚至某些可缩短至4 h内。目前，用于检测金黄色葡萄球菌的成品试剂盒有API、MIS等，以及广东环凯公司生产的显色培养基PEN-CF[7]试剂盒。

3 分子生物学方法

自然界中每一物种都有独一无二的DNA或RNA核酸结构序列，随着生命科学和分子生物科学研究的不断发展，一些菌的核酸序列不断被发现，并作为检测目标，形成了灵敏度高、检测限低、特异性强的检测方法。

3.1 核酸探针技术

核酸探针技术是利用核酸序列，用已知DNA或RNA片段作探针与这些特异核酸序列发生结合，识别标记，然后根据核酸分子间碱基互补配对原则，通过原位、斑点杂交检测核酸序列的同源情况。核酸探针技术优点是特异性强，但其检测周期长，操作繁琐，容易出现假阳性等问题。陈彬等[8]用荧光素去标记金黄色葡萄球菌特异DNA探针，然后与经过增菌处理的金黄色葡萄球菌rRNA杂交，生成RNA和DNA杂交链。在450 nm处用荧光仪读其吸收峰，当峰面积超过其临界数值，说明有金黄色葡萄球菌存在；薛力刚等[9]用吖啶酯特异DNA探针检测金黄色葡萄球菌，此法准确性高；高正琴等[10]利用耐热核酸酶核酸探针技术对金黄色葡萄球菌进行检测，与核酸斑点杂交技术对比，结果相符率达100%。

3.2 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应英文缩写为PCR，是无细胞的克隆技术，或是特异性DNA体外酶促扩增技术[11]。该方法可对DNA序列进行分析，但检测周期长，设备昂贵。Khan等[12]通过PCR法检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，检出率以及灵敏度都达到100%。田静等[13]利用PCR法检测牛奶、肉、冰淇淋等食品中的金黄色葡萄球菌，检出限高达10 CFU/g。

3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增，英文缩写为LAMP。此法是利用4 种特异性引物识别目标基因的特定区域，在BstDNA聚合酶作用下，进行恒温扩增，30～60 min后目标基因数量能达到109～1010个拷贝数量级，实现快速检测目标基因的目的。周义正等[14]利用LAMP技术检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌，其检测结果与传统检测结果一致。

4 免疫学方法

利用特异性标记物如酶、放射性同位素、荧光物质等标记抗原和抗体，通过这些标记的抗原、抗体与抗原抗体特异性物质发生特异性结合，检测这些标记物的含量而达到定性和定量检测。

4.1 免疫磁性微球技术

免疫磁性微球技术检测时间短、精度较高，但成本较高。Yazdankhah等[15]利用酶联免疫吸附和免疫磁性分离相结合的方式检测牛奶中的金黄色葡萄球菌。刘琳琳[16]制备金属螯合免疫磁性微球，用于分离金黄色葡萄球菌的SPA蛋白，进行免疫印记分析检测金黄色葡萄球菌。

4.2 酶联免疫技术

酶联免疫技术灵敏度高、特异性强，但所用的抗原、抗体以及酶标记物等生物制剂稳定性差，不能同时对多种组分进行检测。段鸿斌[17]利用酶联免疫吸附法检测金黄色葡萄球菌的B型肠毒素。陈靖等[18]用此法检测金黄色葡萄球菌的肠毒素，检测结果与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一致。目前，酶联免疫吸附技术主要应用在金黄色葡萄球菌所分泌的肠毒素的检测。

4.3 乳胶凝集技术

乳胶凝集技术操作相对简单，且成本较低，然而致敏的乳胶会因存储条件的不利产生自凝，使灵敏度降低，鲍行豪等[19]采用了反向间接血凝技术，通过反向被动使乳胶凝集，由此检测金黄色葡萄球菌肠毒素。

4.4 免疫荧光技术

免疫荧光技术操作方便、简单且灵敏，但检测荧光设备昂贵。朱广发等[20]采用荧光抗体技术对金黄色葡萄球菌进行快速检测。Khan等[21]将免疫荧光技术与酶联免疫技术结合检测金黄色葡萄球菌肠毒素。

5 生物传感器技术

将生物分子作为生物传感器的敏感元件，把生物代谢生长过程中发生的化学、物理、热、光信号转化为相应的电信号[22]，并将电信号放大，间接检测目标物。朱文杰等[23]利用多通道串联式压电传感器对金黄色葡萄球菌进行检测。

6 计算机视觉技术

综合人工智能、生物学、物理学、图像处理、计算机等技术，通过图像采集分析仪器采集生物图像，通过计算机以及相关程序分析处理图像。计算机视觉检测技术操作简单、成本较低、准确率高、处理速度快、灵敏度高。

7 结论

随着人们对乳制品安全需求的提高，常规的检测方法已不能满足目前社会快速发展的需求，开发方便、快捷、操作简便，成本相对较低的检测方法是未来食品安全检测的发展方向。

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孔祥瑞（1982-），女，本科，研究方向为乳制品检测化验。

2017-06-20）