猪流行性腹泻实验诊断技术的研究进展

叶 丽，汤德元，曾智勇，王 彬，黄 涛，胡玲玲，龙冬梅，石远菊，杨 伟

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪流行性腹泻实验诊断技术的研究进展

叶 丽，汤德元*，曾智勇，王 彬，黄 涛，胡玲玲，龙冬梅，石远菊，杨 伟

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种猪的高度接触性的肠道传染病，该病以排水样稀粪、呕吐、脱水及哺乳仔猪高死亡率为主要特征，给生猪养殖业带来严重危害。猪流行性腹泻于20世纪80年代在我国暴发并流行至今，该病不仅发生范围广、强度大、致死率高，且常与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒及德尔塔冠状病毒等传染病混合感染，临床诊断并不能对该病确诊，必须运用一些实验室方法才能准确诊断该病。通过对猪流行性腹泻的酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(IF)、RT-PCR诊断技术、多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、环介导等温扩增检测技术（LAMP）等几种实验室检测技术进行综述，以期对该病的诊断及确诊提供可靠的实验方法和一定的技术依据。

猪流行性腹泻；PCR技术；LAMP技术；ELISA；免疫荧光法；诊断

猪流行性腹泻(PED) 是由猪流行性腹泻病毒(PEDV) 引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，该病是当前生猪养殖中的一种常见的疾病，也是春、冬季节规模化猪场中导致仔猪死亡的主要原因之一。哺乳仔猪、育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪发病率和死亡率最高。自1978年比利时首先报道分离到该病病毒以来，PED疫情于世界各地相继暴发流行[1]，尤其是从2010年开始，PED暴发更为频繁，造成大量猪只严重腹泻甚至死亡，给养猪业带来了巨大的经济损失[2-4]。

PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒，是冠状病毒科( Coronaviridae) 甲型冠状病毒属 ( Alpha-coronavirus) 的成员，其基因组全长约28 kb，包括5`端非编码区、3`端非编码区以及至少7个开放阅读框(ORF1a，ORF1b，ORF2～6) ，分别编码： 纤突蛋白(S)、膜糖蛋白(M) 、核衣壳蛋白(N) 、小包膜蛋白(E) 和ORF3编码的非结构蛋白[5]。

本文主要从PEDV的酶联免疫吸附试验 (ELISA)、免疫荧光法(IF)、普通RT-PCR 技术、多重PCR技术、实时荧光定量PCR 技术、环介导等温扩增检测（LAMP）技术及病毒分离鉴定等几种实验室检测技术进行综述，以期对猪流行性腹泻的确诊提供参考的实验方法。

1 病毒分离鉴定

病毒分离培养鉴定是比较可靠、灵敏、准确的畜禽疾病检测方法，且即使极少量病毒也可检出。有研究指出，PED 对胰酶有耐受性，初次分离时不易在PK-15、IBRS、Vero等细胞上增殖。

常规方法，是将PEDV接种于Vero细胞，若接种后第2天细胞出现细胞病变（CPE）现象，则几乎可以确诊患有PED。由于考虑到某些特殊情况，还是必须结合其他检测结果，再做出相应的诊断。

2 酶联免疫吸附试验

ELISA是酶免疫检测方法中使用最广泛的技术。该方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，再使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，最后用洗涤法洗去游离成分。

ELISA 检测法是血清学检测的最常用方法之一，目前国内学者对PEDV也进行了大量的研究， 建立了有效的ELISA检测方法。陈茹等[6]使用非洲绿猴肾（Vero）细胞增殖适应传代细胞培养的PEDV，并经聚乙二醇（PEG）沉淀法分离纯化PEDV抗原，建立斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)来检测PED抗体。在最适工作条件下，进行了敏感性和特异性试验，结果显示，该法检测PEDV抗体的敏感、特异、重复性好，且方便、快捷，适用于大批量样品的检测，可作为一种诊断PED的比较理想的方法。使用该方法对国内外种猪群的血清样共834份进行了检测，检出PEDV抗体阳性率为21%。姜艳平等[7]的研究是用原核表达的重组N蛋白作为检测抗原，通过优化ELISA反应条件，建立新的PEDV间接ELISA检测方法。该法对PEDV血清样本检出阳性，而对被猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的血清检测结果均为阴性；对批内、批间分别进行重复性试验，结果表明，变异系数均小于10%。使用建立的ELISA方法检测了130份临床血清样品，检出PEDV抗体阳性78份。该研究表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可用来检测是否感染PEDV，也可进行流行病学调查。以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原，经过一系列条件的优化，建立了PEDV 间接ELISA抗体检测方法。

3 免疫荧光检测

IF分为直接免疫荧光技术（FAT）、间接免疫荧光技术( IFAT)及免疫过氧化物酶技术，3种都是实验室诊断常用方法。若用该法检测呈阳性，且有腹泻症状，则差不多可以确诊为 PEDV。研究证明，FAT是一种比较可靠的检测病料中的 PEDV 抗原的诊断方法，目前该检测方法得到广泛应用。崔现兰等[8]采用 FAT 检测病猪小肠的冷冻切片，检出PEDV人工感染仔猪率为91.4% 。朱维正等[9]分别采用间接血凝试验和 IFAT进行试验比较后，得出 IFAT 法更敏感、高效。林志雄等[10]用可在 Vero、PK15等传代细胞株生长繁殖的PEDV－G1株建立了FAT法。同时，与哈尔滨兽医研究所建立的荧光抗体方法进行比较，结果表明，阳性符合率为95% (19/20)，阴性符合率90%(9/10)。且没有和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒、猪细小病毒和大肠杆菌发生交叉反应。结果表明此方法具有较高的准确性和特异性。

4 RT- PCR检测

RT-PCR方法具有特异性较强、灵敏度较高、重复性好、操作简易等优点，且只需几个小时的实验，便能达到快速检测的目的，该法为PED提供了一种快速、准确的鉴别诊断方法。该法现被用于PED的净化诊断和流行病学调查。

国外，在猪病毒性腹泻方面，Woods、Paton[11]等应用 RT-PCR 技术检测TGEV，证明了RT-PCR检测PEDV是一种比较敏感、特异的诊断方法。Kim、Chae[12]等运用RT-PCR方法对韩国的639个猪场进行了PEDV和TGEV的调查，并通过与其他方法的比较得出RT-PCR方法是目前鉴别诊断PEDV和TGEV最特异、敏感的方法，这与 Kdabota等的研究结果相同。Kim等对原位杂交、免疫组化和RTPCR 3种方法进行了比较，认为RTPCR方法检测PEDV结果的重复性最好。

国内，吴玉璐[13]等针对PEDV的ORF3基因缺失区设计引物，建立了可区分PEDV野毒株与疫苗株的RT- PCR诊断方法，其敏感度可达100TCID50/0.1m L，该方法通过电泳结果根据电泳条带的大小即可得出结论。该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。李海利[14]等根据GenBank中PEDV基因组S基因序列，设计了一对引物（GenBank：AB548624.1），预计扩增基因片段大小为200 bp。结果表明，设计的引物能扩增出目的基因，扩增的基因片段大小与预期的一致，且具有敏感性高、特异性和重复性好等特点。应用建立的条件以及方法，采集临床疑似病例样本16份，其中9份扩增出目的条带，证明此方法具有较好的特异性。该研究为PED的RT- PCR方法的建立提供可靠的依据。

5 多重PCR技术（mPCR）检测

多重PCR技术是在传统PCR技术基础上建立起来的一种快速、可靠的检测技术，它既有传统方法的优点—敏感性高、特异性强，但又优于传统方法，该方法可以在反应中同时检测多种病原，具有简便、快捷、节省耗材等优点，可广泛应用于实验室对多种疫病的鉴别诊断。

国外，Kwonil Jung[15]等用多重反转录巢式聚合酶链式反应鉴定区分PEDV和TGEV；Kim等用RT-PCR方法鉴定区分PEDV和TGEV，检测灵敏度和特异性均可满足实验室诊断的需要。

国内，焦洋[16]等根据PEDV、TEGV以及PBOV的保守区基因序列，参考国内外文献设计并合 成 了3对 引 物：TGEV-S1：5`GTGGTTTTGGTCGTAATGC3`；TGEV-S2：5`ACACTG T G G C A C C C T T A C C T-3`；PEDV-M1：5`-GTCTAACGGTTCTATTCCC-3`；PEDV-M2：5`-TTATAGCCCTCTACAAGG3`；PBOV-NP1：5`-GCAAGGACATCTCCGAAAC-3`；PBOV-NP2：5`-TGAATGCCAGTGAAACCC-3`。建立了可以同时检测这三种病毒的多重检测方法，并对部分临床样品进行了检测，检测结果证明该方法灵敏、特异。应用该研究建立的方法对60份临床病料进行了检测，检出TEGV阳性1份，阳性检出率为1.6%；PEDV阳性4份，阳性率为6.7%；PBOV 阳性13份，阳性率为21.7%。研究结果表明该方法可用于临床腹泻病毒的鉴别诊断。有研究对PEDV、TGEV和PRV进行多重PCR扩增，同时对猪常见的病毒病病原进行PCR扩增，结果显示多重PCR仅扩增出 PEDV、TGEV和PRV的目的条带，而未扩增出其他病毒。该研究还应用建立的方法对78份临床病料进行检测，检测到PEDV阳性37份，阳性率为47.44%；TGEV阳性10份，阳性率为12.82%；RV阳性 4份，阳性率为 5.13%；有2份PEDV、TGEV和PRV均为阳性，阳性率为2.56%。该实验结果表明，阳性样品的PCR检测结果出现3条特异性片段，可用于临床病例的检测与诊断。

6 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR（real-time PCR），是指将荧光基团加入扩增反应体系中，通过实时检测扩增反应中每一个循环产物的荧光信号，再利用标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。应用传统方法进行检测时，扩增反应后还要要进行染色处理和电泳分离，并且该方法只能定性不能定量，这可能造成污染而出现假阳性。real-time PCR技术不仅进行定量检测，且具有较高灵敏度、较好特异性，还有可靠性较好、自动化程度更高以及无污染等特点，以上优点使得荧光定量有取代常规方法的趋势。

实时荧光定量RT－PCR（real-time RT-PCR）是基于传统PCR基础上发展起来的检测技术，自从该技术的出现，PCR实现了从定性到定量的飞跃。该方法能检测10个左右病毒粒子，具有较高的灵敏度。另外，还可对PED病料的病毒量进行定量分析，这点可用于疾病的早期诊断和对PEDV 的感染程度进行定量分析。国内，王金良等[17]运用PEDV株FJ473395的M基因序列设计了一对特异性引物，进而建立了SYBR GREENI荧光定量的PCR方法来检测PEDV，该方法的建立对PEDV初期感染量的诊断提供一定的检测依据。有研究建立了两套实时荧光定量 RT-PCR检测方法。研究人员用该方法对临床上采集的20份疑似病例进行检测，并和常规 PCR方法进行比较，结果显示常规 PCR检测20份待检样品时，有11 份阳性；实时荧光定量RT-PCR检测时，有15份阳性，且常规 PCR检测出的阳性样品用实时荧光定量 RT-PCR 检测时均为阳性，符合率为100%。结果证实该方法可对免疫猪群PED 野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断，特别是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍暴发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。

7 环介导等温扩增技术检测

LAMP技术是依赖一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下扩增出 LAMP特有的梯状条带。该技术通过链置换作用，先利用两条内引物和两条外引物，形成茎环状DNA结构，然后在内引物的作用下通过环介导的自动循环链置换反应大量扩增靶序列。LAMP技术的优点为耗时短、特异性高、不要求有变性的DNA模板，目前该技术被应用于畜牧业基层病原体的快速检测中。LAMP 技术已被国内外广泛应用于对病原微生物的检测。

时建立[18]等为实现对 PEDV 的快速检测，利用PEDV S基因设计特异性引物，建立了检测PEDV的LAMP快速检测方法，此方法特异性好，敏感度强，将反转录后的病毒cDNA稀释到108倍仍可检出，是RT-PCR方法检出量的100倍。汤小真[19]等针对PEDV的NP基因保守区设计1套LAMP 扩增引物，该方法可根据钙黄绿素显色肉眼可视化扩增结果，可检出的最低cDNA的量是3.73 Pg/μL，是RT-PCR方法检出量的10倍，该方法无需昂贵的仪器设备，适合基层实验室使用。

综上所述，PED的防控在PEDV的检测中，近年来研究的侧重点主要是ELISA法和RT-PCR法，这两种方法以其实用性强、高效、快速、准确而被广泛应用。尤其是PCR法 ，比ELISA法更加敏感，特异性也较强。尽管PCR法的敏感性和特异性都很好，但由于对仪器设备等要求很高，特别是荧光定量PCR法对实验操作人员以及实验条件等的要求较为严格，检测成本也较高，因此在推广上仍有很大的限制。在实际工作中，可根据实验室基础条件综合选用合适的检测方法。

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贵州省农业攻关项目资助(黔科合支撑[2017]2579号)

叶丽(1990-)，女，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子生物学的科研学习。

*通讯作者：汤德元（1964-），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。E-mail：tdyuan@163.com

2017-09-05）