红景天苷对心肌缺血-再灌注大鼠心肌梗死面积及细胞凋亡的影响

刘晓丹，潘 涛

·基础医学论著/研究

红景天苷对心肌缺血-再灌注大鼠心肌梗死面积及细胞凋亡的影响

刘晓丹，潘 涛

目的 观察红景天苷对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌梗死面积及心肌细胞凋亡的影响，探讨大株红景天抗MIRI的作用。方法 将SD大鼠按照随机数字表法分为6组，每组6只：假手术组(Sham)、心肌缺血-再灌注模型组(I/R)、红景天苷预防组(红景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、红景天苷治疗组(缺血再灌注+红景天苷，I/R+S)、红景天苷预防组+磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002组(S+I/R+LY组)、红景天苷治疗组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(I/R+S+LY组)。红景天苷预防组和预防组+LY组造模前连续给药3 d；红景天苷治疗组和治疗组+LY组再灌注即刻加予红景天苷；Sham组和I/R组均给予等量生理盐水腹腔注射；预防+LY组和治疗+LY组于冠脉左前降支(LAD)结扎前30 min腹腔注射PI3K特异性抑制剂LY294002。心肌缺血30 min再灌注24 h后，迅速摘取大鼠心脏留取心室，运用Evans’blue及TTC法双重染色，确定心肌梗死区和缺血区面积；运用末端标记法(TUNEL)染色法检测心肌细胞凋亡并计算心肌细胞凋亡指数。结果 与I/R组比较，红景天苷预防组和治疗组均能显著缩小MIRI大鼠的心肌梗死面积(P<0.05)，TUNEL法检测阳性细胞核显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与预防组和治疗组比较，预防+LY组及治疗+LY组心肌梗死面积显著扩大，细胞凋亡指数显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 红景天苷能有效减少MIRI大鼠心肌梗死面积和心肌细胞凋亡指数。

心肌缺血-再灌注损伤；红景天苷；心肌梗死面积；细胞凋亡；磷脂酰肌醇-3-激酶

冠心病是导致人类死亡的主要疾病之一，血运重建是目前治疗冠心病重要的有效手段，成功地血运重建可快速恢复缺血心肌供血及供氧。已有研究证实，再灌注是一把“双刃剑”，它在恢复心肌供血及供氧同时，也使其超微结构、代谢及心肌功能发生新的损伤，甚至出现不可逆的心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。因此，MIRI已成为冠心病治疗过程的焦点问题，在保证再灌注治疗的心肌保护作用不受影响，如何减少再灌注损伤，是当前亟待解决的临床问题。心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡之间有密切关系，并且在心脏生理、病理发展过程中起重要作用，认为是心脏由代偿性变化向病理性变化发展的细胞学基础[2]。中药治疗MIRI疗效确切，许多从中药中分离得到的化合物都具有抗缺血-再灌注损伤作用，其中大株红景天的心肌保护作用受到关注。本研究应用红景天苷对MIRI大鼠进行缺血预处理和治疗，观察红景天苷在对大鼠MIRI心肌梗死面积及心肌细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠，体重220 g±20 g(由南京军区南京总医院实验动物中心提供)。

1.2 主要药物和试剂 红景天苷(南京奥多福尼生物科技有限公司)、10%水合氯醛(中国上海白鹤化工厂生产)、LY-294002 hydrochloride(SIGMA-ALORICH)。Tunel原位凋亡试剂盒：Roche公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)：美国Sigma公司；Evan’s blue：Sigma公司；

1.3 主要仪器 HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)、DH4000A型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)、PAC3 000电泳仪(Bio-Rad)。

1.4 方法

1.4.1 手术及用药 将实验动物按照随机数字表法分为6组，每组6只。假手术组(Sham)：开胸暴露心脏并分离冠脉左前降支(LAD)，只穿线不结扎，直接关胸。心肌缺血-再灌注模型组(I/R)、红景天苷预防组(红景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、红景天苷治疗组(缺血再灌注+红景天苷，I/R+S)、红景天苷预防组+磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002组(S+I/R+LY组)、红景天苷治疗组+PI3K特异性抑制剂LY294002组(I/R+S+LY组)均穿线并结扎LAD起始部，心肌缺血30 min后剪断结扎线，再通闭塞的冠脉，恢复冠脉血流和心肌再灌注，制备I/R模型。心电图稳定10 min后关胸。红景天苷预防组和预防组+LY组在造模前连续给药3 d，每日1次，红景天苷12 mg/kg腹腔注射；红景天苷治疗组和治疗组+LY组再灌注即刻加予红景天苷12 mg/kg腹腔注射；Sham组和I/R组均给予等量生理盐水腹腔注射；预防+LY组和治疗+LY组于LAD结扎前30 min腹腔注射0.3 mg/kg体重的PI3K特异性抑制剂LY294002。

1.4.2 指标检测 Evans’blue-TTC法测量心肌梗死范围，通过计算机图像分析软件计算出梗死区面积(IR)占缺血区面积(ARR)的百分比。心肌梗死范围(IR/AAR)(%)=苍白色面积/(红色面积+苍白色面积)×100%。原位末端标记(TUNEL)法测定细胞凋亡，每个标本片取5个分布均匀的视野作为观察区，正常细胞核呈深蓝色，阳性凋亡细胞核呈棕黄色，分别计数心肌凋亡细胞数，取平均值，凋亡细胞占所计数细胞的百分比为心肌细胞凋亡指数(AI)。

2 结 果

2.1 红景天苷对大鼠心肌梗死范围的影响 梗死范围以梗死区面积(IR)比危险区面积(AAR)表示，详见图1。与I/R组比较，红景天苷预防组和治疗组能显著缩小MIRI大鼠的梗死面积，差异有统计学意义(P<0.05)，预防组与防治组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。缺血前给予 LY294002可以完全消除红景天苷缩小心肌梗死面积的作用，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

I/R组 红景天苷预防组 红景天苷防治组 预防+LY组 治疗+LY组

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较±s) %

注：与手术组比较，*P<0.05；与预防组+LY比较，#P<0.05；与治疗组+LY比较，∧P<0.05。

图2 大鼠心肌梗死范围比较

2.2 红景天苷对MIRI大鼠心肌细胞凋亡率的影响 I/R组凋亡指数与Sham组比较显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而给予红景天苷两组与I/R组比较，阳性细胞核显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，提示红景天苷可减少缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡。红景天苷预防组与治疗组比较，阳性细胞核，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图3、图4。

组别nAISham组62．70±0．72I/R组635．00±1．57预防组6 23．77±2．201)2)治疗组6 29．27±1．331)3)预防+LY组633．63±2．48治疗+LY组632．67±1．29 与I/R组比较，1)P<0．05；与预防+LY组比较，2)P<0．05；与治疗+LY组比较，3)P<0．05。

Sham组 I/R组 预防组

治疗组 预防+LY组 治疗+LY组

注：与手术组比较，*P<0.05；与预防组+LY比较，#P<0.05；与治疗组+LY比较，∧P<0.05。

图4 缺血再灌注后不同组别心肌组织TUNEL染色凋亡指数测定

3 讨 论

MIRI造成的心肌细胞凋亡是心功能不全、心力衰竭的关键因素，细胞凋亡可减少心肌功能细胞数量，心肌收缩能力下降。如何减少心肌细胞在缺血缺氧情况凋亡，成为现今研究热点。MIRI两个主要病理机制是氧化应激和早期炎症反应，有研究表明聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶(PARP)在心肌细胞缺血再灌注损伤发展过程中起重要作用，在MIRI早期，PARP-1明显表达并呈动态变化，给予PARP-1抑制剂，可减轻再灌注给心肌带来损伤，减小心肌梗死面积，早期对心肌再灌注起保护作用；miR-24能抑制心肌细胞缺血缺氧条件下凋亡水平，进而改善心梗后心功能[3-6]。有研究显示，缺血预适应与缺血后适应通过多机制多途径，包括刺激心脏释放G蛋白耦联受体激动剂，激活再灌注损伤救援激酶(RISK)通路(包括PI3K/Akt、PKC、MAPKs、ERK1/2和P38)，抑制促凋亡通路GSK3，并调节ATP敏感的K+通道及线粒体渗透性转换孔(mPTP)功能，发挥对心肌细胞的保护效应[7]。有研究显示，在细胞受到氧化损伤时，PI3K/AKT通路的激活对细胞存活、增殖、减少氧化应激等有重要作用；PI3K/AKT通路激活，可通过对凋亡基因、抗凋亡基因和凋亡相关因子调节及抑制线粒体膜通透性转运孔开放等机制抑制细胞凋亡[8-9]。

本研究应用红景天苷对MIRI大鼠进行预处理和后干预，同时运用PI3K特异性抑制剂LY294002探讨其作用机制，结果显示，红景天苷预防组和治疗组大鼠心肌梗死面积较I/R组缩小和细胞凋亡指数均较I/R组显著降低，证实大株红景天对MIRI具有保护作用；加用PI3K特异性抑制剂LY294002后，红景天苷作用被阻断，初步证实红景天苷对MIRI保护作用与PI3K/Akt通路有关。大株红景天含有红景天苷、酪醇(Tyrosol)、红景天芬(Rosavin)、红景天任(Rozarin)、红景天素(Rosin)及多糖等有效成分，药理学研究显示其有提高心脏泵血功能，降低心肌耗氧量，改善心肌缺血、减轻MIRI、抑制血小板聚集等作用。红景天苷可以扩张冠状动脉，增加冠脉灌流量，并能通过调控线粒体渗透性转换孔(mPTP)开放拮抗低氧诱导的心肌细胞凋亡，减少再灌注损伤[10-11]。临床研究证实，在常规治疗基础上加用大株红景天，可明显降低急性冠脉综合征(ACS)病人血浆脑钠肽前体(NT-proBNP)水平，提高心脏射血分数，明显改善病人心功能[12]。

本研究结果显示，红景天苷可抑制MIRI引起的心肌梗死面积进一步扩大及心肌细胞凋亡，并改善MIRI后心功能，其抗MIRI作用可被PI3K特异性抑制剂消除，但其作用是否有拟PARP-1抑制剂的作用，能否与miR-24协同作用，及其对MIRI相关心肌细胞线粒体的作用，有待进一步深入研究。

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(本文编辑薛妮)

Influence of Salidroside on Myocardial Infarctional Size and Apoptosis Index in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Liu Xiaodan,Pan Tao

The First Clinical College,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China

Pan Tao

Objective To observe the effect of salidroside on myocardial size and apoptosis index in rats with myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI),to investigate the function of salidroside repel MIRI.Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into 6 groups ：sham operation group (S group),ischemia- reperfusion group (I/R group) ,salidroside preventive group(first treating with salidroside and then inducing ischemia -reperfusion) and salidroside treatment group (first inducing ischemia-reperfusion and then treating with salidroside),salidroside preventive + LY294002 group,salidroside treatment + LY294002 group ,6 rats in each group.Both of the salidroside preventive group and salidroside preventive +LY group administered continuously modeling three days before,salidroside treatment group and salidroside treatment +LY group in addition to the salidroside immediate reperfusion.Rats in sham operation group and ischemia- reperfusion group(I/R group) received a same volume of 0.9%NaCl.The salidroside preventive +LY group and treatment +LY group with an additional injection of PI3K inhibitor(LY294002) injection slowly 35 min before ligation.Myocardial ischemia sizes were measured by Evans blue and 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.Myocardium apoptosis rate was measured by TUNEL．Results Compared with I/R group,in both salidroside preventive and treatment groups,myocardial infact size reduced and the apoptosis index lower remarkable (P<0.05),Compared with salidroside treatment group and preventive group ,preventive+LY group and treatment+LY group myocardial infact size increased,apoptosis index increased(P<0.05).Conclusion Salidroside can reduce myocardial infarctional size and apoptosis index in rats with MIRI.

myocardial ischemia reperfusion injury；salidroside；myocardial infact size；apoptosis； phosphatidylinositol 3-kinases

江苏省中医药局基金课题(No.LZ11177)

南京中医药大学第一临床医学院(南京 210029)

潘涛，E-mail：sunmoon6264@126.com

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.010

1672-1349(2016)23-2751-04

2016-07-06)

引用信息：刘晓丹，潘涛.红景天苷对心肌缺血-再灌注大鼠心肌梗死面积及细胞凋亡的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(23)：2751-2754.