铁皮石斛内生菌研究进展

龚 莺，何伯伟，王淑珍，毛碧增*

(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省中药材产业协会 浙江 杭州 310020；3.杭州市农业科学研究院 浙江 杭州 310058)

铁皮石斛内生菌研究进展

龚 莺1，何伯伟2，王淑珍3，毛碧增1*

(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省中药材产业协会 浙江 杭州 310020；3.杭州市农业科学研究院 浙江 杭州 310058)

铁皮石斛作为兰科石斛属的一种珍贵药材，其生长与内生菌密不可分。目前已从生长在不同环境下的铁皮石斛中分离得到多种真菌和细菌，部分菌株对植株具有显著的促生作用。详细总结铁皮石斛内生菌的多样性、内生菌对宿主作用的研究结果，展望了今后的研究方向。

铁皮石斛； 内生真菌； 内生细菌； 促生作用

植物内生菌是指在健康植物中度过近乎全部的生命周期，对寄主植物产生一定间接或直接作用的一类微生物，主要包括真菌和细菌。一方面，寄主植物可为内生菌提供生存所需的环境、营养和能量；另一方面，内生菌依靠自身的生命代谢活动对寄主植物产生影响[1]。已有研究表明，植物内生菌有促进植物生长[2]、增强宿主氮吸收[3]、提高植物抗逆性[4]、提高抗病性[5]等作用。

铁皮石斛是兰科石斛属草本植物，是我国传统名贵中药，为中华“九大仙草”之首，《中华人民共和国药典》2010版特将铁皮石斛单独收载[6]。《中华人民共和国药典》2015版记载铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热的功效，主要用于治疗热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨瘫软[7]。因其广泛的药用价值和显著的药用效果，铁皮石斛已成为制药的主要原料之一。以铁皮石斛(枫斗)为原料的保健食品，全国生产企业55家，产品88个，其中浙江省生产企业15家，产品55个，主要剂型有颗粒剂、胶囊片剂、口服液、浸膏、饮料等。铁皮石斛在制药中的应用也使得其原料的需求量急剧上升。2015年全国种植面积达0.467万hm2，其中浙江省种植面积达2 333 hm2。铁皮石斛被誉为我国民族健康产业和保健食品的典型代表，赢得与人参、灵芝、冬虫夏草同等的市场地位。

中药讲究道地性，即指在一定自然条件、生态环境的地域内所产的药材，因特有的水土、气候、日照、生物分布等，保证了药材的质量[8]。道地药材的形成有三大因素，即生物因素、环境因素和人为因素[9]。野生铁皮石斛多附生于岩石或松木上，并与内生菌共生生长，是影响其药性的因素之一。人工栽培脱离原有生态环境，药材品质与野生型存在一定差异。为探究生物条件的影响，学者们在内生菌对提高铁皮石斛自然成活率、提升组培苗质量、稳定药理作用等方面进行了大量研究，对促进产业发展具有一定的意义。本文着重对铁皮石斛内生菌的多样性和对宿主的生理协同作用进行全面系统总结，以期对内生菌更深入的研究和铁皮石斛产业更好的发展提供一定理论依据。

1 铁皮石斛内生真菌的多样性

铁皮石斛内生真菌资源丰富，目前从不同生境下(四川、云南、福建、河南、广西、湖南、安徽、浙江等)的铁皮石斛中均已发现多种内生真菌，包括担子菌亚门、半知菌亚门和子囊菌亚门的57个属[10-21]。郭顺星等[11]从四川、云南、福建的野生铁皮石斛根部分离得到内生真菌14株，分属于柱孢霉属(Cylindrocarpon)、支顶孢霉属(Acremonium)、瘤菌根菌(Epulorhiza)等11个属；赵昕梅等[12]从河南野生铁皮石斛根部分离得到4株镰孢菌属(Fusarium)和柱霉菌属(Scytalidium)的内生真菌；帅红艳[13]从广西环江产野生铁皮石斛根中分离得到37株内生真菌，分属于镰孢菌属、头孢霉属(Cephalosporium)、拟小卵孢属(Ovulariopsis)等，其中18株真菌具有一定的抗菌活性；毛益婷等[14]从广西乐业雅长兰科植物自然保护区和湖南茛山世界自然遗产风景名胜区的铁皮石斛根中分离得到41株内生真菌，分属于毛壳菌属(Chaetomium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、间座壳属(Diaporthe)等20个属，34个种；吴慧凤等[15]也从湖南茛山铁皮石斛根部组织中分离得到37株内生菌，其中26株为致病菌，11株为非致病菌，非致病菌中有9株为促生菌，这些促生菌分属于小球壳属(Mycosphaerella)、瘤菌根菌属、球座菌属(Guignardia)等。

对铁皮石斛内生真菌的研究不仅仅局限于根部，对茎和叶中的内生真菌也有一定研究。胡克兴等[16]从云南野生铁皮石斛的根、茎、叶中分离得到67株内生真菌，其中根部内生真菌分布最多。通过对产孢真菌进行形态学鉴定，认为其分属于镰孢菌属、链格孢属(Alternaria)、支顶孢属等11个属；对不产孢真菌进行ITS分子鉴定，认为其分属于白粉寄生孢属(Ampelomyces)、节菱孢属(Arthrinium)等7个属。严亮等[17]从云南野生铁皮石斛根、茎、叶中共分离得到16株真菌，分属于脉孢菌属(Neurospora)、粪壳菌属(Sordaria)、毛壳菌属等9个属。郁阳等[18]从安徽地区野生铁皮石斛根、茎、叶中分离得到11株内生真菌，分属炭疽菌属(Colletotrichum)、赤壳属(Cosmospora)、镰孢菌属等5个属，其中茎部内生真菌分布最多。陈泽斌等[19]采用高通量测序技术发现裸胞壳属(Emericella)是云南普洱市野生铁皮石斛叶片中内生真菌的优势种群。李俊峰等[20]从浙江温州雁荡山野生铁皮石斛根、茎、叶中分离得到31株内生菌，真菌22株，茎部内生菌分布最多。5株真菌对大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有抑制作用，其中TG2的抑菌效果最佳，同时经乙酸乙酯萃取得到的发酵代谢产物具有较强的抗肿瘤活性。陈玉栋等[21]从人工培育的三年生健康铁皮石斛根、茎、叶中共分离得到30株内生真菌，根部内生真菌分布最多，其中镰孢菌属和曲霉属(Aspergillus)为优势菌种。

不同生长环境和不同植物器官使得铁皮石斛根部内生真菌种类出现了较多差异，可能与环境湿度、温度等因素有关。从广西和湖南野生铁皮石斛根部分离得到较多菌种，主要为半知菌亚门和子囊菌亚门真菌；云南和浙江温州野生铁皮石斛中也存在较多内生真菌，且根部和茎部的内生真菌相较于叶部更丰富。人工养殖培育的铁皮石斛中同样存在较多内生真菌，说明铁皮石斛与内生真菌密不可分。

2 铁皮石斛内生细菌的多样性

对铁皮石斛内生菌的研究始于真菌，近年来对内生细菌也有较多研究，分离得到的细菌种类较为丰富，涵盖了厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和梭杆菌门的50个属[16,22-26]。张萍[22]从湖南野生铁皮石斛根部分离得到19株内生细菌，其中6株为促生菌，分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、苍白杆菌属(Herbaspirillum)、肠杆菌属(Enterobacter)等5个属，其对种子的萌发、原球茎的生长、铁皮石斛组培苗有显著的促进效果，同时具有一定的固氮、解磷、产铁载体和分泌IAA的功能。俞婕[23]从萧山、奉化、庆元采集的铁皮石斛根部和茎部分离出134株内生细菌，并从中筛选出11株优势菌种，其中9株为芽孢杆菌属细菌，具有一定淀粉酶、卵磷脂酶和固氮酶活性。章华伟等[24]从浙江天台山采集的野生铁皮石斛根、茎、叶中共分离得到23株内生菌，经过鉴定分属于土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属、泛菌属(Pantoea)等7个属。周小风等[25]采用传统分离法和PCG-DGGE法首先研究了铁皮石斛不同组织中内生菌的分布，发现根部分离得到22株细菌，主要为芽孢杆菌属细菌；茎部分离得到22株细菌，主要为伯克氏菌属(Burkholderiaceae)细菌；叶部分离得到17株细菌，主要为假氨基杆菌属(Pseudaminobacter)细菌。其次研究了不同种植基地对铁皮石斛内生细菌多样性的影响，发现从温州铁皮石斛中分离鉴定44株细菌，分属于短波单胞菌属(Brevundimonas)、假氨基杆菌属等19个属。从丽水庆元铁皮石斛中分离鉴定了42株细菌，分属于假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)等16个属。从萧山铁皮石斛中分离鉴定了40株细菌，分属类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、伯克氏菌属等22个属。从奉化铁皮石斛中分离鉴定了50株细菌，分属于细杆菌属(Microbacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)等23个属。从温州野生铁皮石斛中分离鉴定了17株细菌，分属13个属，从丽水庆元野生铁皮石斛中分离鉴定了11株细菌，分属4个属。野生铁皮石斛中分离得到了寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、草螺旋菌属(Herbaspirillum)、泛菌属等5个有别于人工铁皮石斛内生菌的菌属，这些菌属具有固氮、解磷脱硫、促生等功能。胡克兴等[16]从云南野生铁皮石斛中分离得到28株细菌，分属于芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)等10个属。王明月等[26]从人工种植的二年生铁皮石斛中分离得到49株内生细菌，其中根中分离得到24株，茎中分离得到15株，叶中分离得到10株，荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)、环形芽孢杆菌(Bacillusaxarquiensis)为优势菌种。

铁皮石斛不同组织中内生菌多样性的研究和不同生长环境对铁皮石斛内生菌多样性的研究发现芽孢杆菌属细菌为主要菌种，同时人工培育的铁皮石斛中亦存在大量芽孢杆菌属细菌，说明该属细菌在铁皮石斛生活史中发挥了重要的作用。

3 铁皮石斛内生菌对宿主的作用

植物内生菌在一定阶段或全阶段生存于植物体内，与植物形成一种互利共生的关系。铁皮石斛为兰科植物，内生菌在其生长过程中发挥了重要的作用。吴慧凤等[15]将湖南野生铁皮石斛中分离得到的非致病菌与铁皮石斛共培养，菌种促生效果显著，部分菌种使接菌苗鲜质量增长率高出对照组30%，出芽数高出对照组80%～140%。俞婕等[27]从浙江桐庐铁皮石斛中分离得到10株内生细菌，其中ZJSH1菌株的102稀释菌剂能均匀附着在培养基上并促进组培苗生长，同时该菌株接种共生后的铁皮石斛组培苗平均干重比对照组高15.9%。俞婕等[28]也从浙江奉化铁皮石斛中分离得到内生细菌52株，其中部分菌株具有蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和一定的固氮活性。赵昕梅等[12]从河南野生铁皮石斛中分离得到4株镰孢菌属和柱霉菌属的内生真菌，并通过发酵液喷施的方法筛选得到1株促生菌，该菌株对铁皮石斛组培苗具有显著的促生作用，其成活率提高30.43%，植株高度增加31.21%，鲜重增加40.61%。张萍等[29]从铁皮石斛中分离得到19株内生细菌，其中6株为促生菌，对铁皮石斛种子萌发、原球茎和组培苗生长有较好促生效果。将这6株促生细菌与8株促生真菌进行非拮抗筛选，在25组非拮抗组中筛选获得6组处理，新根数、根分枝率、分蘖数和净鲜重都显著高于单一菌种处理组。董金海等[30]从安徽霍山铁皮石斛中分离得到NL-215菌株，与铁皮石斛组培苗共生培养后发现该菌株有明显的促生长作用，组培苗各项指标均有显著增加，接菌苗净增重量为对照的2.63倍，株高为对照的1.25倍，分株数为对照的1.14倍，根数为对照的1.27倍，新增叶数为对照的1.29倍，新芽数为对照的2.06倍，叶绿素a增加38.28%，叶绿素b增加43.93%，总叶绿素含量为对照的1.41倍，多糖含量增加45.93%。侯晓强等[31]从石斛属植物中分离得到36株内生真菌，并筛选得到8株促生菌，其对铁皮石斛组培苗的鲜重、茎粗、新根新芽数量等生理指标都有一定程度的促进作用，部分菌株表现显著促生作用。朱波等[32]将从活树附生的铁皮石斛中分离得到的真菌接于组培苗中共培养，采用苯酚-硫酸法、热浸法，并结合HPLC，综合筛选发现4株菌种可提高根数、叶数、茎粗等农艺性状，促进铁皮石斛茎节变紫，总多糖含量分别提高113.7%、70.7%、196.0%、157.4%，极显著高于对照组。这些研究说明，内生菌对铁皮石斛的生长有促进作用，且对品质也有提高，同时真菌和细菌的共同作用较单一菌株有一定优势。

4 展望

铁皮石斛具有很高的药用价值，因其生长速度慢、种子自然萌发率低等原因，近年来对其有较多的研究。内生菌与植物的生长密不可分，铁皮石斛作为兰科植物的一种，其生长与菌根真菌存在联系[33]，因此对铁皮石斛内生菌的研究也越来越多。目前对铁皮石斛内生菌的研究主要为内生菌的分离鉴定、内生菌的多样性以及促生菌的筛选。在研究范围和研究深度上还有欠缺。传统内生菌的分离鉴定为组织块分离法、形态学鉴定和分子水平鉴定结合。陈泽斌等[19，25]突破传统方法，利用高通量测序技术、PCG-DGGE法，鉴定获得大量菌种，为提高菌种鉴定的准确性提供了良好的借鉴。促生菌的筛选均选用组培苗进行研究，缺乏盆栽试验以及田间试验应用。同时，对促生作用研究大部分局限于菌体定殖共培养和菌液喷洒灌溉，对菌体代谢产物研究较少。铁皮石斛具有抗肿瘤、提高免疫力等药理作用，其内生菌代谢产物是否也具有这些作用值得更深入的研究。另外，内生菌的作用研究仅以促生为主，还可进行其他方面的探索，比如病害防治、污染治理等。铁皮石斛内生菌的研究将为提高铁皮石斛自然生长率、提高有效物质积累以及后续药理研究提供重要参考价值。

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(责任编辑：张瑞麟)

2017-05-22

浙江省公益性技术应用研究专项(2014C32099)；浙江省“三农六方”科技协作计划项目(ZJ-SN-201409)；浙江省农业中药材新品种选育重大科技专项(2016C02058-3)

龚 莺(1993—)，女，浙江杭州人，在读硕士，从事植物病害研究工作，E-mail: gyygrace904@126.com。

毛碧增，研究员，博士，从事植物生物技术、中药材品种选育与品质改良工作，E-mail: maobz@zju.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170825

S567

A

0528-9017(2017)08-1372-04

文献著录格式：龚莺，何伯伟，王淑珍，等. 铁皮石斛内生菌研究进展[J].浙江农业科学，2017，58(8)：1372-1375.