基于液体透镜的激光诱导荧光检测装置设计

胡馨然，牛礼军，胡晓明，周 雅



基于液体透镜的激光诱导荧光检测装置设计

胡馨然1a，牛礼军2，胡晓明1b，周 雅1a

( 1. 北京理工大学a. 光电学院；b. 生命学院，北京 100081；2. 中国电子科技集团公司第四十一研究所，安徽蚌埠 233000 )

针对共聚焦型激光诱导荧光检测技术对微米尺度微流控芯片沟道检测存在对焦困难，检测精度受离焦影响严重的问题，本文提出了一种利用液体透镜连续变焦实现微沟道自动对焦的激光诱导荧光检测装置，并针对系统设计了基于图像清晰度评价的自动调焦算法。装置根据采集的微流控芯片沟道图像自动调整聚焦点位置，保证最优的激发光与诱导荧光收集。实验结果表明：本文设计的激光诱导荧光检测装置可实现对微流控芯片沟道的快速自动对焦，波动范围在0.5%之内，变异系数为1.5‰。它为提高微流控芯片的检测精度和设计灵活性提供了可能。

微流控芯片；激光诱导荧光检测；液体透镜；自动调焦

0 引 言

自二十世纪九十年代初来自瑞士的Manz等人提出了微全分析系统(Micro Total Analysis System, μTAS)的概念后[1]，微流控芯片技术不断发展，对分析仪器走向微型化、集成化、自动化的方向做出了重要贡献[2]。它是一种以在微米尺度的空间中对流体进行操控为主要特征，将生物和化学实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米大小的芯片上。由于微流控芯片尺度小，沟道宽度和深度尺度都在微米量级，检测精度对实验结果分析至关重要。微流控芯片的检测根据检测方式分为多种，而激光诱导荧光检测技术(Laser Induced Fluorescence Detection，LIFD)是用于微流控芯片检测的灵敏度最高的检测技术之一。

激光诱导荧光检测是至今为止针对微流控芯片检测使用最早，应用最广泛的光学检测[3]，它的检测灵敏度可达10-9～10-13mol/L。与非共聚焦型LIFD相比，共聚焦型LIF检测器对荧光与激发光、反射光、杂散光的分离更为完全，可以有效改善检测灵敏度和信噪比，具有较高的检测灵敏度，但系统共焦检测也给检测条件和手段要求提高了。目前的检测方法通常是通过人工手动调节对焦，检测重复性受人为因素影响较大。针对这个问题，刘翻[4]等人设计的三维可调共聚焦激光诱导荧光检测器中对激光光斑位置的调整采用了一种三维反射镜调节装置；刘云亮等人[5]设计的基于共聚焦原理的激光诱导荧光检测器中对激光光斑对焦位置的调整采用了一个三维移动平台；李伟[6]等人设计的共聚焦式激光诱导荧光检测装置中利用三个电控位移台来实现移动对焦。上述设计都是依靠移动整体光学成像系统，改变光学系统的成像物平面实现焦点位置调焦。虽然调整过程可以使用自动来代替手动，一定程度上扩展了使用灵活性，但是靠机械移动部件完成成像物面调整来实现自动调焦，控制灵活度和测量精度仍然有限。同时机械结构移动的不稳定会带来一定的误差和噪声，影响调焦结果。为了解决这个问题，我们提出了一种采用液体透镜结合自动调焦算法实现微沟道自动对焦的检测，使LIFD装置可以根据采集的微流控芯片沟道图像实现自动对焦，保证检测结果质量的同时也可以保证激光的激发效率。

1 液体透镜自动对焦LIFD系统设计

1.1 自动对焦LIFD总体系统设计

经典的共聚焦LIFD结构如图1(a)所示，激光发射光束由二色镜反射后，经显微物镜的聚焦把激光束聚焦在检测沟道内，诱发的荧光经显微物镜收集穿过二色镜和滤光片后，由光电倍增管探测其强度，另一方面在二色镜后方加入CCD摄像机监视沟道情况，有利于聚焦、观察和图像采集操作。激发光束的汇聚点和产生的荧光汇聚点在同一条直线上，因此称为共聚焦型LIF检测器。

图1 共聚焦激光诱导荧光检测系统

图2 基于液体透镜激光诱导荧光检测装置结构图

共焦检测的结构可以滤除大部分的杂散光，提高检测精度，但也给检测条件和手段提高了要求。当使用LIFD对微控流芯片进行检测时，LIFD是否准确对焦对检测结果有很大影响。由共聚焦LIFD原理示意图可以看出，激光光源的聚焦位置为实际的检测窗口，该聚焦位置与微流控芯片的检测沟道的三维空间重合程度极大的影响了装置的检测能力与检测重复性。由于加工精度的限制造成检测液流的空间位置与激光诱导荧光装置的预设位置有偏差，这就是共聚焦型LIFD的主要检测误差来源。如图1(b)所示，只有理想焦平面上的物体光束才能通过光阑，为光电倍增管收集。而对于偏离理想焦平面的位置，大部分光线会被光阑阻挡，无法进入系统。微流控芯片结构特征尺寸一般在十几到几十个微米，当没有正对焦面时，一方面，会造成本来就相对较弱的检测荧光收集能量大幅减弱，导致信噪比降低；另一方面，共焦结构的激发激光也因离焦造成激发能量降低，对共焦型检测结果质量影响很大。

液体透镜是一种基于仿生学的光学器件，它利用某种控制方法改变透镜的折射率或形状来调整焦距，实现焦距的连续变化。将液体透镜引入变焦距光学系统而不需要引入任何机械运动部件将会给变焦光学系统的发展带来革命性的变化[7-8]。在本文中，我们在激光诱导荧光检测装置中使用液体透镜，结合LIFD中的显微物镜实现变焦光学系统。

由图1(a)分析可以知道，光电倍增管收集的荧光和样品是共轭关系，CCD上沟道图像和样品是共轭关系。可以通过使用CCD采集图像对沟道聚焦情况进行判定[6]。图2是本文中设计的基于液体透镜的激光诱导荧光检测装置。装置由共聚焦光学系统、液体透镜和计算机组成。微流控芯片通过共聚焦光学系统成像，CCD摄像机将采集的芯片沟道图像传输给主控计算机，计算机根据计算结果控制液体透镜焦距改变实现轴向自动对焦。

1.2 LIFD系统自动对焦评价算子设计

在激光诱导荧光检测中，沟道清晰成像是聚焦判断依据。图像清晰度反馈自动调焦是通过清晰度评价函数对采集图像清晰度评价，反馈相应电学参数，进而控制光学系统调整系统参数，直至最终得到最清晰的像。图像清晰度评价的自动调焦灵活性好，不需要引入机械运动部件，因此本文采用图像清晰度评价控制完成自动调焦。

清晰度评价函数性能会直接影响对焦效果。理想的调焦评价函数应该具有良好的无偏性，单峰性和较高灵敏度。此外，在显微镜观测的情况下，应该还需要较好的实时性和稳定性。目前常见的数字图像评价函数主要有灰度变化函数、梯度函数、图像灰度熵函数和频域类函数[9]。经常用于自动调焦中的评价函数有Tenengrad函数、Brenner函数、Roberts梯度函数、Sobel梯度函数、Laplacian函数、Variance 函数等[10]。对于微流控芯片沟道图像，沟道边缘锐利程度不大，灰度分布不均匀，Laplacian等对边缘敏感的评价函数可能会出现偏差，同时，由于微流控芯片沟道图像中目标体积不大，背景体积大，因此需要考虑尽量大的模板来减小背景的影响。基于以上特点，选取基于SUSAN算子的评价函数[11]来完成自动对焦算法。SUSAN算法能有效的对图像进行角点提取和边缘检测[12]。它使用一种近似圆形的模板。用模板在图像上移动，模板内每个图像像素点的灰度值()都与模板中心像素的灰度值(0)作比较，若模板内某个像素的灰度与模板中心像素(核)灰度差小于设定阈值，则认为该点与核具有相同或相近的灰度，可由下式描述：

所有满足这一条件的像素组成的区域称为核值相似区(Univalue Segment Assimilating Nucleus, USAN)，计算式如下式：

当圆模板越接近边缘和角点时USAN的值越小，反之越大。当USAN小于设定阈值时，即认定此点为边缘点。

在自动对焦的过程中，图像越清晰，包含的边缘信息越丰富，含有大于零的(0)分量越多；反之，图像越模糊，图像所含有的大于零的(0)分量越少。因此，将对焦窗口内各点(0)值的绝对值的和作为图像的清晰度评价函数，则在图像对焦窗口的Rect区域内，计算式为

我们对液体透镜输出连续同向驱动电流使液体透镜焦距连续变化，采集微流控芯片沟道从离焦到对焦再到离焦状态的41幅图像。如图3是41幅图片中6个不同焦深的示例。用SUSAN函数对41幅图像进行处理，得到结果如图4。图中横坐标是图片的编号，纵坐标是评价函数的清晰度评价值。实验结果中可以看出，基于SUSAN算子的清晰度评价函数曲线单峰性好，误差较小；评价曲线较光滑，具有良好的单峰性，无偏性以及尖锐性，适合LIFD的自动调焦算法。

图3 不同离焦状态下的6幅图片

图4 SUSAN算子处理图像结果

2 基于液体透镜的LIFD自动调焦实现

2.1 LIFD自动调焦实验系统设计

为了验证本文提出的基于液体透镜自动对焦的LIFD系统，设计了调焦系统的验证实验。实验检测的微流控芯片是一个长75 mm，宽26 mm，沟道宽度和深度都是50 μm的电泳芯片，如图5所示。实验装置如图6，微流控芯片置于基座上，使用白光LED阵列辅助光源照明。采用宁波远明激光技术有限公司的半导体泵浦激光器LSR473HOEM-50作为激发光源，Optotune公司液体透镜EL-10-30-Ci[13]结合40倍显微物镜构成共焦光学系统物镜组对微流控芯片成像；使用MINTRON公司的型号为MTV-1881EX-3的CCD作为图像传感器；共焦系统成像清晰度评价和自动变焦控制由计算机完成。

图5 微流控芯片

图6 基于液体透镜的激光诱导荧光检测装置图

调焦实验中，我们使用评价函数反馈控制输出电流对液体透镜的焦距进行控制，实现连续变焦。液体透镜EL-10-30-Ci的控制源是一个恒流源，其电流大小为0 mA到300 mA，常温下电压不超过5 V。EL-10-30-Ci中有两个腔体，腔体内分别填充入两种折射率不同的液体，两个腔体间由一个弹性聚合物薄膜分隔，图7给出了液体透镜的变焦过程。图7(a)中，给液体透镜加上低电流时，透镜的焦距较大；图7(b)中，给液体透镜加上高电流时，透镜焦距较小。图7(a)中箭头的位置是变焦时控制部分施加压力的位置，这个压力使沟槽内的液体被挤压到靠近中心的位置，中心位置明显凸起，即曲率半径发生变化，最终使液体透镜的焦距发生改变。

在调焦过程中，我们使用登山式控制算法进行反馈调节控制液体透镜电流。登山式控制算法[14]的原理图如图8。变焦过程从点开始，首先向某一方向改变一个步进值，对两次所在位置的结果进行比较，通过评价值大小关系判断出峰值所在的方向。然后开始以最大的步进值向峰值方向运行。直到产生1<2的情况就能够判断算法已经过了峰值焦距点，于是从1开始以一个较小的步进值反方向进行运算。不断重复这个过程，即找到降低点，换用更小的步进值反方向计算，最终直到步进值已达到最小并且产生降低现象时，此处的值即可以认定为本次计算的峰值。实验中，首先采集一幅图像，对图像进行评价，再往某个方向改变调节参数的一个步进值，再采集图像并进行评价，比较两个评价值大小，判断出峰值所在方向，并调整步进值，直至找到评价峰值即对焦准确的位置，完成自动对焦。

图7 液体透镜的调焦原理图

图8 登山式控制算法原理图

2.2 基于液体透镜的LIFD自动调焦实验

使用LIFD对微流控芯片进行检测时，会出现两种可能的离焦情况：实际距离大于工作距离和实际距离小于工作距离。为了验证本文设计的液体透镜自动调焦算法在这两种情况下的性能，我们设计了两组实验来验证。当实际距离大于和小于工作距离时初始位置和调焦后图片如图9和图10所示。

图9 大于工作距离自动调焦过程

图10 小于工作距离自动调焦过程

2.3 LIFD自动调焦稳定性评价

2.2的实验结果可以证明，本文设计的基于液体透镜自动对焦的激光诱导荧光检测装置在针对微流控芯片检测中，能够根据采集到的微流控芯片沟道图像实现自动对焦。

在实际的检测应用中，调焦结果的重复性也是系统的重要评价指标。因此，本文还设计一组重复性实验来检验系统稳定性。使用系统对同一距离目标进行了10次自动调焦实验，控制电流变化在80 mA到130 mA之间。表1是10次自动调焦实验初始图像评价值和最后稳定图像评价值。

将10次调焦实验最后稳定的图像评价值记录并归一化得到图11。从图11中，可以看出，10次自动调焦图像完成的评价值较稳定，近似为一条直线。直线波动范围内0.5%之内。变异系数(方差除以均值)为1.5‰。可以看出基于液体透镜自动对焦的算法稳定好。

表1 10次自动调焦实验初始评价值和最终评价值

图11 自动调焦算法稳定性实验

3 结 论

与现有的传统的依靠机械移动的变焦距光学系统相比，本文提出的基于液体透镜自动对焦的激光诱导荧光检测装置，具有良好的单峰性，无偏性和稳定性的SUSAN算子清晰度评价函数设计自动对焦算法。实验证明本文设计的激光诱导荧光检测装置可实现对微流控芯片沟道的快速自动调焦，并且10次完成调焦时的图像评价值稳定，波动范围在0.5%之内，稳定性好，为提高微流控芯片的检测精度和设计灵活性提供了可能。

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A Novel Laser Induced Fluorescence Detection Device Based on Liquid Lens

HU Xinran1a，NIU Lijun2，HU Xiaoming1b，ZHOU Ya1a

( 1. a. School of Optoelectronics;b. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China；2. The 41st Institute of China Electronics Technology Group Corporation, Bengbu233000, AnhuiChina)

Laser Induced Fluorescence Detection (LIFD) technology is one of the most sensitive means for the microfluidic chip detection in which application field it is important to achieve accurate focus due to the small size of microfluidic chip. A novel LIFD based on liquid lens is proposed to obtain the optimal excitation light and the induced fluorescence collection, which is capable of adjusting focus position in three-dimension automatically according to the information provided by the images. The autofocus algorithm for LIFD is accomplished with the combination of SUSAN operator and the mountain climbing control algorithm. A tunable liquid lens based on LIFD experimental prototype is set up to testify the proposed system and algorithms. Experimental results show that the system can achieve the autofocus of microfluidic chip. The repeatability experimental results indicate that the evaluation of the last picture in each single experiment has a steady feature with a fluctuation of 0.5% and coefficient of variation of 1.5‰. It provides a solution to improving the detection accuracy and a design flexibility of microfluidic chip.

microfluidic chip; laser induced fluorescence detection; liquid lens; auto-focus

1003-501X(2016)12-0058-07

TH74

A

10.3969/j.issn.1003-501X.2016.12.010

2016-03-14；

2016-06-02

北京高等学校青年英才计划(YETP1170)

胡馨然(1993-)，女(汉族)，湖南株洲人。硕士研究生，主要研究工作是光电仪器研究。E-mail：huxinranbit@163.com。