AntagomiR-103协同阿霉素对TGF-β1诱导的HepG2细胞转化及生长的影响*

王金利， 张 敏

(1.无锡市惠山区人民医院, 江苏 无锡 214187； 2.贵州医科大学, 贵州 贵阳 550004)



AntagomiR-103协同阿霉素对TGF-β1诱导的HepG2细胞转化及生长的影响*

王金利1， 张 敏2**

(1.无锡市惠山区人民医院, 江苏 无锡 214187； 2.贵州医科大学, 贵州 贵阳 550004)

目的： 探讨antagomiR-103协同阿霉素(ADM)对TGF-β1诱导肝癌细胞(Hep G2)发生上皮-间质细胞转化(EMT)及Hep G2细胞存活率的影响。方法： Hep G2细胞体外培养，设为control组、TGF-β1组、TGF-β1+ADM组、TGF-β1+microRNA inhibitor N.C组、TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C组、TGF-β1+antagomiR-103组、TGF-β1+ADM+antagomiR-103组及使用western-blot检测EMT标志蛋白N-Cadherin、E-Cadherin、vimentin的表达水平；设control组、TGF-β1组、antagomiR-103组、TGF-β1+antagomiR-103组，用不同浓度的ADM作用于各组细胞24 h，使用MTT法检测细胞存活率，并计算IC50。结果： 与control组相比，antagomiR-103+ADM组E-Cadherin表达上调，N-Cadherin、Vimentin表达下调；细胞存活率随ADM浓度的增高而逐渐降低；在ADM浓度相同的条件下，不同药物预处理组之间进行比较，当ADM浓度为25 mg/L时，antagomiR-103+ADM组的细胞存活率明显低于其他组。结论： antagomiR-103联合ADM可抑制TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活。

药物疗法，联合； 肝肿瘤； 细胞； antagomiR-103； 阿霉素； 上皮细胞-间充质细胞转换； TGFβ-1

目前临床上治疗肝癌一般采取手术为主，辅以化疗的综合治疗方案[1]，化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗效果，但肿瘤细胞容易对化疗药物产生多药耐药性导致化疗失败[2]。临床常用于治疗肝癌的化疗药物阿霉素(doxorubicin,ADM)是一种周期非特异性抗癌化疗药，对各期细胞均有很强的细胞毒性作用，其作用机制是通过插入并解开DNA的双螺旋链，改变DNA的模板性质，抑制DNA聚合酶，从而抑制细胞DNA和RNA合成[3-4]。邓立力等[5]发现，ADM可以促进细胞表面死亡受体的表达，诱导肝癌细胞凋亡，肝癌患者在长期使用ADM后很容易产生耐药性。有研究发现，在肿瘤发生上皮-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)过程中，miRNA作为具有调控功能的小分子RNA与肿瘤对化疗药物的反应有密切联系[6]。本实验通过微小RNA(microRNA，miRNA)干扰技术，设计合成miRNA-103的阻断试剂antagomiR-103，对肝癌细胞(Hep G2)进行干预，将antagomiR-103与ADM共同作用于Hep G2细胞，观察两者对肿瘤细胞存活率的影响，检测EMT标志蛋白N-Cadherin、E-Cadherin、vimentin的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

人肝癌细胞系Hep G2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，胎牛血清为HyClone公司产品，DMEM培养基为Gibco公司产品，胰蛋白酶为美国Ameresco公司产品，antagomiR-103、antagomiRNA-MUT、has-miR-103、microRNA mimics N.C、microRNA inhibitor N.C由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，阿霉素为深圳万乐药业有限公司产品，E-Cadherin、N-CadherinBioworld和Vimentin抗体均购自Bioworld生物科技有限公司，其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(CKX41，日本Olympus公司)，超低温冰箱(MDF-382E，日本SANYO公司)，恒温CO2 培养箱(Model 310，美国Thermo公司)，全自动雪花制冰机(IMS-40，常熟市雪科电器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2 使用10%胎牛血清(FBS)+DMEM培养基混合液，置于37 ℃、CO2体积分数为5% 孵箱中培养，将2×107/mL的Hep G2细胞接种于6 cm培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM置于5% CO2孵箱中培养24 h后，更换无酚红无血清的DMEM培养2 h，加入含10%胎牛血清的DMEM，继续培养24、48 h后收集细胞，完成后续试验。

1.2.2 EMT标志蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin检测 将体外培养的Hep G2细胞分为control组、TGF-β1组、TGF-β1+ADM组、TGF-β1+microRNA inhibitor N.C组、TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C组、TGF-β1 + antagomiR-103组及TGF-β1+ ADM+antagomiR-103组；收集培养细胞，加入全细胞裂解液每皿80 μL，-20 ℃、14 000 r/min离心20 min；收集上清，BCA法测定蛋白浓度，取30 μg总蛋白行SDS-PAGE电泳，在300 mA、1 h的条件下将蛋白转移至PVDF膜，用5 g/L脱脂奶粉TBST稀释液封闭1 h后用E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，用TBST洗涤后加入相应二抗孵育2 h后ECL法进行显影，检测E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白的表达。

1.2.3 细胞增殖能力 对数生长期的Hep G2细胞用0.25%的胰酶消化后，以细胞浓度为 8×103/mL接种于96孔板内，每张板设空白调零组、阴性对照组、ADM组、ADM+TGF-β1组、ADM+antagomiR-103组及ADM+TGF-β1+antagomiR-103组；ADM设8个药物浓度(C1～C8)分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg/L；ADM+TGF-β1组为加入上述C1～C8的ADM和5 μg/L TGF-β1，ADM+antagomiR-103组为加入上述C1～C8的ADM和100 nmol/L antagomiR-103，ADM+TGF-β1+antagomiR-103组为加入上述C1～C8的ADM和100 nmol/L antagomiR-103及5 μg/L TGF-β1；每组均设6个复孔。细胞加药后继续培养48 h，弃去培养液，向各孔加入MTT液，使细胞与0.25% MMT在37 ℃、5% CO2孵箱中继续培养4 h，弃去上清液，加入DMSO 200 μL低速振荡10 min，结晶震荡溶解后，通过酶标仪于490 nm波长处测定各孔光密度，计算IC50值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1N-Cadherin、E-Cadherin、vimentin表达

western-blot结果显示，与control组细胞相比，TGF-β1组中N-Cadherin、Vimentin表达上调、E-Cadherin表达下调；与TGF-β1组细胞相比，TGF-β1+antagomiR-103组中N-Cadherin、Vimentin表达下调、E-Cadherin表达上调;TGF-β1+ADM+antagomiR-103组中N-Cadherin、Vimentin表达下调、E-Cadherin表达上调；差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果说明antagomiR-103与ADM共同作用于TGF-β1诱导的HepG2细胞，可以明显抑制细胞发生EMT。

注：1为control组,2为TGF-β1组,3为TGF-β1+ADM组,4为TGF-β1+microRNA inhibitor N.C组,5为TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C组,6为TGF-β1 + antagomiR-103组,7为TGF-β1+ ADM+antagomiR-103组图1 各实验组EMT相关蛋白的表达(western blot)Fig.1 Expression of EMT related protein in each experimental group

2.2 ADM对Hep G2细胞存活率的影响

将Hep G2细胞分为control组、8个不同浓度ADM组，体外培养24 h后，使用MTT法检测不同浓度ADM对Hep G2细胞存活率的影响。结果显示，与control组细胞相比，随着ADM浓度的增高，细胞存活率随之显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。当ADM浓度增高至50、100 mg/L时，HepG2细胞存活率与其他剂量组相比略有增高，原因不明。经统计学分析计算得出ADM的半数抑制浓度(IC50)为6.699 mg/L，见图2。

表1 ADM对Hep G2细胞存活率 的影响Tab.1 The negative effect of ADM onHep G2 cell survival

(1)与control组比较，P<0.01

注：(1)与control组比较，P<0.01图2 ADM对Hep G2细胞存活率的影响Fig.2 The negative effect of ADM on Hep G2 cell survival

2.3 ADM对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响

用TGF-β1(5 μg/L)诱导Hep G2细胞发生EMT，同时给予不同浓度ADM处理细胞24 h，MTT法检测ADM对细胞存活率的影响。结果显示，与TGF-β1组相比，细胞存活率明显下降, 差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。经统计学分析计算，ADM的IC50为8.698 mg/L，是ADM作用于未发生EMT的Hep G2细胞的IC50的1.3倍，提示ADM对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞的作用减弱，促进细胞凋亡的能力降低，当ADM浓度增高至50、100 mg/L时，细胞存活率与其他剂量组相比略有增高，见图3。

表2 ADM对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响Tab.2 The negative effect of ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

注：(1)与control组比较，P<0.01

注：(1)与control组比较，P<0.01图3 ADM对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响Fig.3 The negative effect of ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

2.4 antagomiRNA-103与ADM共同作用对Hep G2细胞存活率的影响

用antagomiR-103(100 nmol/L)和8个不同浓度的ADM共同作用于Hep G2细胞24 h，MTT法检测ADM对Hep G2细胞存活率的影响。结果显示，与antagomiR-103组相比，ADM+antagomiR-103组的细胞存活率明显下降(P<0.01),见表3。经统计学分析计算，ADM和antagomiR-103共同作用于Hep G2细胞，其IC50为3.826 mg/L，与ADM单独作用于Hep G2细胞的IC50相比明显降低， ADM组中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103组中ADM的IC50的1.75倍，ADM+TGF-β1组中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103组中ADM的IC50的2.27倍，见图4。提示antagomiR-103可以促进ADM诱导的细胞凋亡，两者有协同作用。当ADM浓度增高至50、100 mg/L时，细胞存活率与其他剂量组相比略有增高。

表3 antagomiR-103与ADM共同作用对Hep G2细胞存活率的影响Tab.3 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on Hep G2 cell survival

(1)与antagomiR-103组相比，P<0.01

(1)与antagomiR-103组相比，P<0.01图4 antagomiR-103与ADM共同作用对Hep G2细胞存活率的影响Fig.4 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on Hep G2 cell survival

2.5 antagomiR-103与ADM共同作用对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响

用antagomiR-103(100 nmol/L)和8个不同浓度的ADM共同作用于TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞24 h，MTT法检测antagomiR-103与ADM对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响。结果显示，与control组、antagomiR-103+TGF-β1组相比，ADM+antagomiR-103+TGF-β1组的细胞存活率明显下降(P<0.01),见表4。经统计学分析计算，ADM和antagomiR-103共同作用于TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞，ADM的IC50为3.913 mg/L，与ADM单独作用于Hep G2细胞时ADM的IC50相比明显降低， ADM组中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103+TGF-β1组中ADM的IC50的1.71倍；ADM+TGF-β1组中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103+TGF-β1组中ADM的IC50的2.22倍，见图5。提示antagomiR-103与ADM共同作用于TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞，可以促进细胞凋亡，两者有协同作用。当ADM浓度增高至50、100 mg/L时，细胞存活率与其他剂量组相比略有增高。

表4 antagomiR-103与ADM共同作用对TGF-β1 诱导发生EMT的Hep G2细胞 存活率的影响Tab.4 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

(1)与antagomiR-103+ TGF-β1组相比，P<0.01

(1)与antagomiR-103+ TGF-β1组相比，P<0.01图5 antagomiR-103与ADM共同作用对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响Fig.5 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

3 讨论

EMT的发生与多种因素有关，受到多种细胞调控因子的调控，如TGF-β[7]、FGF[8]、EGF[9]等，可以诱导EMT的发生，也可以引起肿瘤细胞的增殖。Akhurst RJ[10]研究发现，肿瘤细胞系被转入外源性TGF-β1后都出现不同程度的上皮表型缺失，获得侵袭特征，阻碍TGF-β受体可以阻止EMT的发生和肿瘤细胞侵袭。ADM是一种广谱、高效抗肿瘤的蒽环类化合物，对各期细胞有很强的细胞毒性作用，可破坏细胞膜的结构和功能，可以通过p53依赖或p53非依赖的途径来诱导细胞凋亡[11]，这可能是ADM引起细胞存活率下降的原因之一。

在本实验中，TGF-β1诱导发生了EMT的Hep G2细胞存活率与对照组相比无明显差异，原因可能是EMT的抗凋亡作用，推测发生EMT的细胞激活了抗凋亡的信号通路或抗凋亡的因子生成，如Wnt/β-连环素信号通路下游靶基因survivin、eyelinDI，可促进细胞周期进程、引起细胞增殖和抑制细胞凋亡[12]。但是细胞由上皮细胞表型转化为间质细胞表型，可能也是抗凋亡的一个关键因素。TGF-β1可诱导肝脏实质细胞发生凋亡，存活下来的细胞发生EMT，获得一定的抗凋亡活性[13]。

在本实验中，ADM单独作用于TGF-β1诱导的Hep G2细胞，与control组、TGF-β1组相比，EMT的标志性蛋白E-Cadherin、N-Cadherin及Vimentin表达变化不明显，差异无统计学意义；antagomiR-103与ADM共同作用于TGF-β1诱导的Hep G2细胞，与TGF-β1组相比，N-Cadherin表达下调、E-Cadherin表达上调、Vimentin表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)，这些结果表明，ADM对TGF-β1诱导的Hep G2细胞发生EMT未表现出抑制作用，antagomiR-103与ADM共同作用于TGF-β1诱导的Hep G2细胞，对细胞发生EMT有抑制作用。antagomiR-103联合化疗药物ADM共同作用于TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞，使用MTT法检测ADM对Hep G2细胞存活率的影响, 结果显示，细胞存活率随着ADM浓度的增高而降低，ADM对TGF-β1诱导发生EMT的Hep G2细胞存活率的影响；细胞存活率随着ADM浓度的增高而降低，但与单独使用ADM组相比，在相同浓度ADM作用下，细胞存活率变化并无明显差异，可能与TGF-β1的增殖和诱导EMT的作用有关，antagomiR-103与化疗药物ADM共同作用于Hep G2细胞对其存活率的影响。结果显示，细胞存活率随着ADM浓度的增高而明显降低，在ADM浓度为25 mg/L时，与单独使用ADM组、单独使用antagomiR-103组细胞存活率相比明显降低(P<0.01)，有统计学意义；antagomiR-103与ADM共同作用于TGF-β1诱导发生EMT 的Hep G2细胞，MTT检测细胞存活率，结果还显示，与control组、antagomiR-103+TGF-β1组相比，ADM+antagomiR-103+TGF-β1组的细胞存活率明显下降(P<0.01)。

综上所述，antagomiR-103对TGF-β1诱导的Hep G2细胞EMT的发生有抑制作用，与ADM共同作用于Hep G2细胞也明显引起细胞存活率降低，使ADM半数抑制浓度明显降低，这些结果的发现考虑可能与其它信号通路或miRNA协同、拮抗作用相关，但是具体的作用机制本实验尚未深入探讨，将在今后的实验中继续深入研究。利用miRNA的基因干预调控阻断肝癌细胞的EMT，同时辅以化疗药物治疗肝癌具有很高的可行性，将对临床肝癌转移、复发的防治具有重大意义。这可能为揭秘肿瘤侵袭和转移的机制提供更为可靠的理论依据，为肿瘤患者的治疗带来新的希望。

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(2016-08-29收稿，2016-11-06修回)

中文编辑： 刘 平； 英文编辑： 刘 华

Effects of AntagomiR-103 and ADM on TGF-β1 Induced EMT and Growth of Hep G2 Cell

WANG Jinli1, ZHANG Min2

(1.thePeople'sHospitalofHuishanDistrict,Wuxi214187,Jiangsu,China; 2.DepartmentofPharmacology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of antagomir-103 synergized by ADM on epithelial mesenchymal transition (EMT) in Hep G2 induced by TGF-β1 and on the cell survival rate of and Hep G2 cells. Methods: Hep G2 cells were cultivated in DMEM with 10% fetal calf serum and divided into the control group, the TGF-β1 group, TGF-β1+ADM group, TGF-β1+microRNA inhibitor N.C group, TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C group, the TGF-β1+antagomiR-103 group, and the TGF-β1+ ADM+antagomiR-103 group. Western-blot was adopted to detect the expression level of EMT, E-cadherin, vimentin and N-cadherin in all these groups. On the other hand, the Hep G2 cells were also divided into the control group, TGF-β1group, antagomiR-103 group, TGF-β1+antagomiR-103. With different concentrations of ADM on each above group for 24 h, MTT method was used to detect cell survival rate, and IC 50 was calculated. Results: Compared with control group, the expression of E-cadherin was up-regulated in antagomiR-103+ADM group, while N-cadherin, vimentin expression was down regulated. The cell survival rate decreased with the increase of ADM concentration. The cell survival rate of antagomiR-103+ADM group was significantly lower than that of the other groups at the same ADM concentration and when the ADM concentration was 25 mg/L. Conclusion: antagomiR-103 combined with ADM can inhibit transformation of TGF-β1 induced EMT and growth of Hep G2 cell.

drug therapy,combination; liver neoplasms; cells; antagomiR-103; adriamycin; epithelial-mesenchymal transitions; TGFβ-1

贵阳市科技局基金项目[(2011103)17号]

时间：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.010.html

R329.25； R575.2

A

1000-2707(2016)12-1424-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.013

**通信作者 E-mail:1071632869@qq.com