基于纳米金等离子体共振光散射法测定阿米卡星

邹明静，王 娜

(1.菏泽医学专科学校中心实验室，山东菏泽 274030；2.商丘医学高等专科学校，河南商丘 476000)

基于纳米金等离子体共振光散射法测定阿米卡星

邹明静1，王 娜2

(1.菏泽医学专科学校中心实验室，山东菏泽 274030；2.商丘医学高等专科学校，河南商丘 476000)

为简便、快速地对阿米卡星的注射液进行检测，基于纳米金颗粒的等离子体共振效应建立了一种检测阿米卡星的新方法。在适宜pH值的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中，利用阿米卡星与纳米金相互作用，使反应体系在640 nm处共振光散射信号显著增强，且共振光散射强度增强值ΔI640 nm与阿米卡星质量浓度在1.5～500 ng/mL范围内线性相关，检出限为0.52 ng/mL。在确定的实验条件下，阿米卡星可诱导纳米金颗粒聚集，纳米金颗粒之间距离的变化使其等离子体共振效应发生明显改变，聚集的纳米金颗粒表面等离子体耦合产生了较强的共振光散射信号，且共振光散射信号增强值与阿米卡星的浓度变化值呈现良好的线性关系。实验表明，该方法可用于快速测定阿米卡星。

光谱分析；纳米金；阿米卡星；等离子体效应；共振光散射

阿米卡星为氨基糖苷类抗生素，对多数肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌及部分其他假单胞菌、产碱杆菌属等具有较好的抗菌活性，临床上用于抗感染治疗，是一种广谱抗生素[1]。目前测定阿米卡星的方法主要有微生物法、高效液相色谱法、荧光法、化学发光法、毛细管电泳法等[2-6]。微生物法可真实反映生物效价，但操作复杂，灵敏度低且耗时。由于阿米卡星结构缺乏生色基团，荧光法在测定前多需采用荧光试剂或其他试剂进行衍生，导致操作方法繁琐，实验干扰因素较多。高效液相色谱法灵敏，结果可靠，但仍采用柱前衍生，繁琐的检测过程及较为昂贵的检测成本限制了其应用。纳米金颗粒具有量子效应和表面效应，在化学、医药和材料学等诸多领域中得到了广泛应用[7-8]。

纳米金颗粒可因诱导作用发生聚集，纳米颗粒之间距离的变化会使其等离子体共振效应发生改变，金属纳米粒子的颜色随之改变并产生强烈的光散射信号[9-11]。据此，可将利用药物分子诱导纳米金颗粒聚集所建立的光散射分析法用于药物小分子的测定。共振光散射光谱法具有快速、简便、灵敏等特点，已广泛应用于痕量无机物和有机物的分析[12-15]，而将纳米金等离子体共振光散射分析法用于阿米卡星的检测目前尚未见报道。本研究发现，在适宜pH值条件的Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，阿米卡星可诱导纳米金颗粒聚集形成更大的金颗粒，产生较强的等离子体共振光散射信号，并据此建立了一种测定阿米卡星的共振光散射光谱分析新方法，用于阿米卡星注射液的检测，方法简便、快速，结果比较满意。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

CRT970型荧光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司提供)；UV2100型紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器(集团)有限责任公司提供)； H-600 透射电镜(日本电子株式会社提供)；TP-350S磁力加热搅拌器(杭州米欧仪器有限公司提供)；MTC-100振荡型恒温金属浴(杭州米欧仪器有限公司提供)；RU-T25超纯水仪(上海同田生物技术有限公司提供)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司提供)。

阿米卡星标准品(Sigma公司提供)：4 μg/mL；1.0%(质量分数，下同)HAuCl4(国药集团上海化学试剂有限公司提供)；1.0%(质量分数，下同)柠檬酸钠；pH值为2.6～8.0的柠檬酸-Na2HPO4溶液；pH值为4.49～9.18的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液：取一定量(0.067 mol/L)的KH2PO4溶液，与一定量(0.067 mol/L)的Na2HPO4溶液按一定比例配制；所用试剂均为分析纯；实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金[16]：取超纯水100 mL，放入锥形瓶中，煮沸；加入1.0%的柠檬酸钠溶液5.00 mL，保持沸腾5 min；快速加入1.0%的HAuCl4溶液1.00 mL，磁力搅拌并持续加热保持沸腾15 min；冷却至室温并定容至100 mL，于4 ℃保存。用透射电镜观察制备的纳米金颗粒形貌及粒径大小，发现金颗粒为球形，粒径约为12 nm，详见图1。

图1 纳米金透射电镜图Fig.1 Transmission electron microscopy of gold nanoparticles

在1.5 mL的EP管中，依次加入0.10 mL pH值为6.24的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液、一定量的阿米卡星标准溶液、0.60 mL的纳米金胶，准确稀释至1.00 mL，振荡混匀后反应5 min。用UV2100型紫外-可见分光光度计记录其吸收光谱。用荧光分光光度计，采用微量石英比色皿，设置λex=λem条件下同步扫描，获得该体系的共振光散射光谱。在640 nm 波长处测定产物的共振光散射强度I640 mm，并测定其空白值(I640 mm)b，计算ΔI640 mm=I640 mm-(I640 mm)b。

1.3 条件选择

1.3.1pH值、缓冲溶液用量

实验考察了pH值为2.6～8.0的柠檬酸-Na2HPO4及pH值为4.49～9.18的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液对体系ΔI640 mm的影响。结果表明：采用柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液，空白值高但ΔI640 mm较小，缓冲溶液的离子强度对纳米金颗粒的聚集有明显的影响；在pH值为5.91～7.17的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中，ΔI640 mm均较为稳定，当pH值为 6.24时，体系的ΔI640 mm最大(见图2)。故本文选用pH值为6.24的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液，其用量为0.15mL。

图2 pH值对ΔI640 mm的影响Fig.2 Effect of pH value on ΔI640 mm

1.3.2 纳米金胶用量

纳米金胶用量对体系ΔI640 mm的影响如图3所示。结果表明：ΔI640 mm随纳米金胶加入量的增加而相应增大。当纳米金胶用量为0.40～0.70mL(ρ(Au)=22.4～40.6μg/mL)时，ΔI640 mm较大。本文选择0.60 mL纳米金胶，即34.8 μg/mL的纳米金胶。

图3 纳米金胶用量对ΔI640 mm的影响Fig.3 Effect of colloidal gold on ΔI640 mm

1.3.3 温度与时间

本文选择10，20，30，40 ℃体系，考察温度对体系ΔI640 mm的影响。结果表明：ΔI640 mm在10～40 ℃的恒温金属浴条件下均较为稳定，5min后即趋于稳定。可见，温度对该反应体系的影响较小，本文选择在常温条件下反应5min后用于测定。

2 结果及讨论

纳米金颗粒具有表面等离子共振耦合效应，相比分散的胶体金颗粒，聚集的纳米金颗粒可产生较强的散射光信号[17]。阿米卡星为氨基糖苷类抗生素，在适宜的pH值条件下，阿米卡星的氨基与柠檬酸钠还原法制备的纳米金颗粒可因静电作用结合[18]，导致纳米金颗粒发生聚集，使共振光散射信号增强。再者，阿米卡星在一定浓度范围内与散射光强度增强值之间存在良好的线性关系，据此可建立基于纳米金等离子体共振光散射测定阿米卡星的新方法。

2.1 吸收光谱

将阿米卡星溶液加入纳米金胶中，随着阿米卡星加入量的增加，反应产物溶液的颜色由酒红色逐渐转变为深紫色，对于质量浓度为0，100，200，400 ng/mL的阿米卡星，最强的吸收峰位置分别为521，532，539，553 nm。反应产物最强吸收峰随阿米卡星质量浓度的增大出现了红移(见图4)。有研究报道，纳米金微粒的吸收峰随其粒径增大而红移[19]，据此表明阿米卡星能够诱导纳米金颗粒发生聚集，形成粒径更大的颗粒。

a—pH值为6.24的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-0 ng/mL阿米卡星；b—pH值为6.24的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-100 ng/mL阿米卡星；c—pH值为6.24 的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-200 ng/mL阿米卡星；d—pH值为6.24 的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-400 ng/mL阿米卡星。图4 纳米金与阿米卡星体系吸收光谱图Fig.4 Absorption spectra of Amikacin with gold nanoparticles

2.2 共振光散射光谱

阿米卡星的共振光散射信号很弱。纳米金胶溶液在620 nm和640 nm处存在较为明显的共振光散射峰。纳米金胶溶液中加入阿米卡星后，在470，620，640 nm处均出现了明显的散射峰，散射峰的强度显著增强，亦表明阿米卡星能诱导纳米金发生明显聚集。本研究选择测定了640 nm的共振光散射强度，见图5。

a—400 ng/mL阿米卡星；b—pH值为6.24 的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-0 ng/mL阿米卡星；c—pH值为6.24的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-100 ng/mL阿米卡星；d—pH值为6.24的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-200 ng/mL阿米卡星；e—pH值为6.24的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液-33.6 μg/mL纳米金胶-400 ng/mL阿米卡星。图5 纳米金与阿米卡星体系共振光散射光谱图Fig.5 Resonance light scattering spectra of Amikacin with gold nanoparticles

2.3 工作曲线

按实验方法确定最佳实验条件，测定不同质量浓度阿米卡星对应的共振光散射强度ΔI640 mm。以阿米卡星质量浓度ρ对ΔI640 mm作图，阿米卡星在1.5～500 ng/mL范围内与ΔI640 mm之间存在良好的线性关系。回归方程为ΔI640 mm=1.97ρ+16.31(n=7，R2=0.995 4)，检出限为0.52 ng/mL。表明本方法简便快速，灵敏度高。

2.4 共存物质的影响

按实验方法，考察了共存物质对测定200 ng/mL 阿米卡星的干扰情况，控制相对误差为±5%。结果表明：常见的金属离子(如Na+，K+，Ca2+，Zn2+)，非金属离子(如F-，Br-，I-)及葡萄糖、蔗糖等均不干扰测定，故该方法具有较好的选择性。

2.5 样品分析

取市售不同厂家阿米卡星注射液5 μL，放入25 mL容量瓶中，稀释至刻度。准确移取20 μL，按实验方法测定，并与高效液相色谱法进行比较[20]，结果见表1。由表1可以看出，实验结果与厂家标示值一致，表明数据可靠。

表1 阿米卡星注射液测定结果

针对不同厂家的阿米卡星注射液，加入一定量的阿米卡星标准品，采用标准加入法测定其回收率，测得回收率为96.5 %～107.5 %(见表2)，结果满意。实验表明，该方法可用于准确测定阿米卡星注射液中阿米卡星的含量。

表2 阿米卡星注射液回收率测定

3 结 语

通过对纳米金胶和阿米卡星反应体系的吸收光谱和共振光散射光谱分析可知，阿米卡星可诱导纳米金颗粒聚集，聚集的纳米金颗粒因表面等离子体的耦合，在640 nm处可产生很强的共振光散射信号，该散射信号的增强值与阿米卡星的质量浓度呈现良好的线性关系。该方法已用于市售阿米卡星注射液的测定，并完成了样本的回收实验，结果均较满意。因此，依据阿米卡星对纳米金颗粒的诱导聚集作用，基于纳米金颗粒表面等离子体效应的改变所建立的检测方法，可简便、快速地对阿米卡星的注射液进行检测。

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Plasmon resonance light scattering spectral assay of Amikacin based on gold nanoparticles

ZOU Mingjing1， WANG Na2

(1.Central Laboratory, Heze Medical College， Heze， Shandong 274030, China；2.Shangqiu Medical College， Shangqiu， Henan 476000， China)

In order to conveniently and fastly test Amikacin injection，a new method for detection of Amikacin is established based on the plasmon resonance effect of gold nanoparticles. In KH2PO4-Na2HPO4buffer with proper pH value, the resonance light scattering intensity at 640 nm is enhanced greatly due to the interaction of gold nanoparticles and amikacin, and ΔI640 nmis linear proportional to the concentration of Amikacin in the range of 1.5～500 ng/mL, and the detection limit is 0.52 ng/mL. Under certain experiment condition, gold nanoparticles are aggregated induced by Amikacin, and the distance variation makes its plasmonic resonance effect change greatly. The aggregated nanoparticles surface plasmon coupling produces strong resonance light scattering signal, and the resonance light scattering signal shows a good linear relationship with the concentration of Amikacin. The experiment shows that the method can be used to detect Amikacin rapidly.

spectroanalysis； gold nanoparticles； Amikacin； plasmonic effect； resonance light scattering

1008-1534(2017)01-0018-05

2016-11-04;

2016-12-08；责任编辑：张士莹

山东省高等学校科技计划项目(J11LB01)；菏泽医学专科学校科研项目(H14k05)

邹明静(1982—)，女，重庆梁平人，讲师，硕士，主要从事分子光谱分析方面的研究。

E-mail：mingjingzou@126.com

O656.3

A

10.7535/hbgykj.2017yx01004

邹明静，王 娜.基于纳米金等离子体共振光散射法测定阿米卡星[J].河北工业科技,2017,34(1):18-22. ZOU Mingjing，WANG Na.Plasmon resonance light scattering spectral assay of Amikacin based on gold nanoparticles[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2017,34(1):18-22.