糖尿病周围神经病变实验动物模型研究进展

饶军华 ， 徐世千 ， 孙云霄 ， 张洪钿 ， 李比海 ， 肖百全

(广东省生物资源应用研究所 广东省动物保护与资源利用重点实验室广东省野生动物保护与利用公共实验室 ， 广东 广州 510260)

糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一种严重威胁人类健康的慢性疾病[1]，该疾病本身对机体的损伤有限，其众多的并发症是人类健康的主要威胁，严重影响患者的生存质量，甚至危及患者生命。DM的主要并发症主要包括神经病变、肾病、眼病、心脏病等。据统计，50%以上的糖尿病患者都患上以上一种或几种并发症[2]。糖尿病周围神经病变(Peripheral Diabetes Neuropathy, PDN)是糖尿病的主要并发症之一，发病率(60%～70%)高[2]，对患者的损伤大，临床以对称性麻木、电击样疼痛、腹胀、汗出等表现为主，特别是持续性蚁(虫)爬状麻木和电击样疼痛严重影响患者的生存质量[3]，后果极其严重。

自20世纪60年代起，国内外学者开始对 PDN进行研究，但由于其发病的复杂性，迄今为止， PDN的发病机制仍未被破解，该领域的动物模型研究的成熟度也相对较低，这给治疗 PDN药物的研发也带来了较大的障碍。目前，多数学者认为 PDN的发病与周围神经的神经端退化、脱髓鞘有关[4]，当患者的周围神经进行性出现末梢到近端震动和热感知阀值上调，患者继而出现疼痛、体虚、感觉缺失[2]等异常感觉。虽然 PDN的发病机制尚不清晰，但国内外学者并未停止对该领域进行研究，数十年来进行了大量的试验，本文就国内外学者对 PDN模型的研究进行总结，发现各模型的优势和不足，为后续研究者对 PDN模型研究以及 PDN药物的研发提供借鉴。

1 PDN动物模型及其优缺点比较

1.1 自发性PDN模型

1.1.1 高脂饲料诱导PDN雌性C57BL6/J小鼠模型 2007年Obrosova[5]等采用高脂饲料饲喂雌性C57BL6/J小鼠16周后诱导出糖尿病前期及肥胖C57BL6/J小鼠模型并使其罹患PDN，该模型与人的糖尿病前期患者和肥胖患者相似。高脂诱导的小鼠出现周围神经功能异常，但其结果并未改变，该模型适合在糖尿病早期评估饮食或药理学方法阻止或逆转糖尿病神经病变的效果。该模型的优点：运动和感觉神经传导不畅，有触摸痛及热痛觉迟钝。缺点：(1)皮内神经纤维减少，轴突萎缩；(2)不能用于慢性糖尿病神经病变研究；(3)尚未被治疗PDN的药物验证。

1.1.2 自发性T1DM PDN Ins2 Akita小鼠模型 Choeiri等[6-7]研究发现，34周龄以上的高血糖症小鼠若不控制血糖将出现周围神经病变。该动物模型胰岛β细胞数量减少，伴随高胰岛素血症，感觉神经传导速度(SNCV)降低。该模型的优点：(1)属自发性糖尿病模型，与人类 PDN并发症出现相似度较高；(2)进行性和持续慢性高血糖症；(3)感觉神经传导速度降低；(4) 树突和轴突明显膨胀；(5)发病机制与其他齿啮类动物和人相似。其缺点是尚未被治疗糖尿病或PDN的药物验证。

1.1.3 瘦素不足的PDN (ob/ob)小鼠模型 2006年Drel等[8]研究发现，给ob/ob小鼠饲喂普通小鼠饲料并保持中等程度高血糖症时，动物的运动和感觉神经传导明显减缓，并累及周围神经山梨醇通路的中间产物的代谢。造模至第11周时，表皮内神经纤维急剧减少(约78%)。该模型已成功用于PDN药物醛糖还原酶抑制剂的评估。其优点：(1)有明显热痛觉迟钝反应；(2)非禁食血糖水平相对较高；(3)降低运动和感觉神经传导；(4)明显降低表皮内神经纤维；(5)已被治疗PDN的药物验证。其缺点是还不能广泛地用于治疗糖尿病或PDN药物的药理学筛选。

1.1.4 自发性糖尿病PDN WBN/Kob大鼠模型 1993年Yagihashi等[9]通过检测12～20月龄的大鼠电生理、生化及外周神经结构变化，发现了一种自发性糖尿病大鼠PDN模型。自发性糖尿病WBN/Kob大鼠会出现髓鞘脱落, 病症以运动神经病变为主，后期伴随轴突的变化。该模型的优点：(1)减慢运动神经传导，合成肌肉动作电位暂时性消失；(2)在12个月龄时，结构性脱髓鞘或髓鞘再生；(3)轴突变性，代谢紊乱，或在20个月龄时有髓鞘纤维减少；(4)类似于人的周围神经病变发病机理。其缺点是尚未被治疗PDN的药物验证。

1.1.5 自发性糖尿病PDN恒河猴模型 1989年Cornblath等[10]曾尝试建立自发性糖尿病恒河猴PDN模型。他们发现，与非糖尿病动物相比，糖尿病动物能显著降低运动神经传导速度(MNCV)并延迟F波的出现。此外，糖尿病组动物自出现高血糖症起2年内运动纤维的神经传导次数增加。该模型的优点：(1)明显减少运动传导速度；(2)延长F波的峰潜时；(3) 发病机制与人类相似，国内动物资源较丰富。其缺点：(1)运动诱发的振幅无区别；(2)延长神经传导诱导时间(约2年)；(3)尚未被治疗PDN的药物验证。

1.1.6 遗传性PDN中国仓鼠模型 1982年Kennedy等[11]对遗传性的糖尿病中国仓鼠周围神经病变模型并其解剖学及生理学进行了研究发现：中国仓鼠后肢神经的运动和感觉组份降低了16%～22%，但神经纤维直径未减少并且与生理效应相关形态学指标均正常。该模型的优点：适于作为PDN模型。缺点是：(1)PDN病变与人类的相似度不高，不及人类糖尿病神经病变的临床症状严重；(2)尚未被治疗PDN的药物验证。

1.2 化学药物诱导的PDN模型

1.2.1 STZ诱导的PDN小鼠模型 1978年Robertson等[12]用STZ诱导基因突变的C57BL/Ks (db/db)小鼠获得PDN模型。该模型初期出现运动神经传导速度(MNCV)严重降低，缺少大的有髓神经纤维、轴突萎缩症状；末期在有髓或无髓纤维中可观察到轴突营养障碍，并伴随髓鞘受损、收缩及分解等情况。该模型的优点: (1) 明显降低运动神经传导速度(MNCV)；(2)缺乏大量的髓鞘纤维；(3) 轴突萎缩；(4)有髓鞘纤维和无髓鞘纤维的轴突营养缺陷；(5)髓磷脂减少、萎缩或崩溃。缺点：动物被STZ损伤过，与人类1型糖尿病的发病机理比较相似，与人类2型糖尿病的发病具有比较大的差异，此外该模型也尚未被治疗糖尿病或PDN的药物验证。

1.2.2 STZ诱导的PDN大鼠模型 2006年Rodrigues F O等[13]将STZ单次注入10只大鼠皮下，大鼠出现血糖升高并出现了PDN症状。糖尿病大鼠的膈神经与对照组相比，有髓轴突的直径变小。该研究证实，常规的胰岛素治疗能预防或纠正有髓鞘轴突神经细胞的变性。该模型的优点：(1)可以明显地减少左右丛生区及膈神经髓鞘的形成；(2)可以用于胰岛素的验证。其缺点：(1)PDN的特征仍不清楚；(2)动物模型为血清胰岛素分泌绝对不足型模型，与人类的 PDN的发病存在一定的差异，虽然可以用胰岛素验证，但尚未用于治疗PDN药物的筛选和验证。

1.2.3 STZ诱导的PDN C57BL6/J 小鼠模型 2008年Vareniuk等[14]采用单剂量(100 mg/kg体重)STZ注射到非禁食的野生型和iNos基因缺陷型小鼠，6个月后诱导出C57BL6/J 小鼠PDN模型。研究发现，iNos基因在糖尿病神经病变的周围神经、结构与功能变化的过氧亚硝酸基受损中起关键作用。该模型的优点：(1)周围神经和背根神经细胞的过氧亚硝酸基受损；(2)运动和感觉神经传导速度降低，热和机械感觉过敏，触觉异常，内表皮神经纤维。其缺点是尚未被治疗PDN药物的验证。

1.2.4 STZ诱导的糖尿病感觉神经病变ddY小鼠模型 2013年Murakamil等[15]将STZ单次注射到8周龄的ddY小鼠(1周后血糖升高到16.7 mmol/L)，他们制备出感觉神经病变ddY小鼠模型。该模型的优点：(1)可明显降低感觉神经传导速度，更高的疼痛阀值，痛觉迟钝，无髓鞘纤维萎缩；(2)成功地用于胰岛素治疗评估；(3)可作为人类多发性神经病变研究的一种比较好的模型。缺点是在髓鞘神经纤维区域无明显变化。

1.2.5 蔗糖诱导的PDN OLETF大鼠模型 2006年Kamenov等[16]用富含蔗糖食物饲喂OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠2个月龄后成功诱导出PDN OLETF大鼠模型。研究发现，试验组动物的血糖和糖化血红蛋白明显升高，神经传导速度(MNCV)和热痛觉反应明显降低，疼痛阀值增加。该模型的优点：(1)血糖及糖化血红蛋白水平明显升高；(2)运动神经传导速度和热伤害感受水平降低。其缺点：(1)PDN的主要机制尚不清楚，模型动物血糖、糖化血红蛋白水平未见明显升高，与人类存在较大的差异；(2)尚未被治疗PDN的药物验证。

1.3 STZ诱导结合手术方法诱导的 PDN模型

1.3.1 神经病变RIP/IFNβ(Rat insulin I promoter/human interferon-beta)转基因ICR小鼠模型 2010年Serafin A等[17]用低剂量(30 mg/kg体重)的STZ连续5天注射6周龄的RIP/IFNβ转基因ICR小鼠并辅以左侧坐骨神经损伤的方法开发出一种PDN模型。该模型的优点：(1)明显的高血糖症，胫骨感觉神经传导速度明显变慢；(2)降低神经纤维密度并增加运动延迟反应。其缺点：(1)需要采用复杂的外科方法以及药物损伤制备该模型；(2)尚未被治疗糖尿病药或PDN的药物验证。

1.3.2 STZ诱导的大鼠疼痛模型 1999年Fox等[18]、2003年Kale B等[19]在STZ诱导糖尿病模型基础上，通过手术分离并结扎坐骨神经使后肢发生溃疡坏疽，获得PDN模型，该模型可评价神经干多层次减压对糖尿病神经病变的疗效。该模型的优点：(1)产生持续长时间的机械热痛觉过敏但不出现热痛觉过敏；(2)已用于治疗PDN的药物评价。其缺点是主要的发病机制不清楚。

1.4 外科手术法诱导的 PDN模型 2010年Muthuraman等[20]对大鼠股动脉进行缺血-再灌注制备了大鼠血管神经炎模型。研究发现，该模型能降低血清IL - 10和神经传导速度和增加血清硝酸盐、丙二醛(MDA)和TNF-α水平；神经纤维密度的减少出现在中度和重度I/R组；温和的缺血再灌注损伤(4 h) 模型可以用来探索病理生理机制，也可用于评估新的止痛剂、外围神经血管性物质和神经保护药物。该模型的优点：(1)爪和尾出现热/ 机械性痛敏反应；(2)神经纤维密度和神经传导速度降低；(3)诱导期十分短。其缺点：(1)尚未被治疗PDN的药物验证；(2)发病机制与人类 PDN发病机制有较大的差异。

1.5 基因修饰动物周围神经病变模型

1.5.1 PDN遗传改良的C57BL/Ks (db/db)小鼠模型 2013年 Hinder等[21]敲除db/db或ob/ob小鼠的ApoE和ApoB48基因后建立了血脂异常的PDN模型。该模型的优点：(1)增加动物体重、出现高血糖症和高脂血症；(2)降低对热刺激的尾弹反应，降低坐骨运动神经传导速度和表皮内神经纤维速度。其局限性：(1)体重、血糖、血浆脂质及糖化血红蛋白的结果不一致；(2)尚未被治疗糖尿病及PDN的药物验证。

1.5.2 基因修饰的SDT肥胖大鼠模型 2012年Yamaguchi等[22]通过导入ZDF大鼠(Zucker Diabetic Fatty)的fa等位基因开发出PDN大鼠模型。该模型除了具备持续高血糖症、脂代谢紊乱外，还能在24周龄时明显延迟或降低神经传导速度，在40周龄时明显降低腓肠神经纤维的数量。此外，该模型还出现硬膜小动脉增厚的症状。该模型已用于治疗糖尿病的药物—吡格列酮的评价，它能明显改善运动神经传导速度和糖化血红蛋白水平。因此，该模型对于了解PDN发病机理及筛选和开发治疗PDN药物都是一种比较好的模型。该模型的优点包括：(1)持续高血糖症和脂代谢紊乱且能延迟和降低运动神经传导速度；(2)降低腓肠神经纤维数量、硬膜小动脉增厚；(3)成功地用于治疗糖尿病药物(如，吡格列酮)的评价。

2 小结与展望

自20世纪60年代以来，研究人员采用膳食诱导法、化学诱导法、化学诱导结合手术法、单纯手术法、基因修饰法等方法在小鼠、大鼠、中国仓鼠、恒河猴等实验动物上开发出多种PDN模型，但大多数的动物模型尚未被治疗糖尿病或治疗PDN的药物验证。成功的PDN模型应具备以下3个基本特征[23]：(1)应尽可能的模拟人类 PDN发病的主要过程；(2)动物模型应具备糖尿病患者发病的基本特征，如高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗等，在此基础上诱发 PDN；(3)模型应该对治疗糖尿病或治疗PDN的药物敏感，利于治疗 PDN药物的研发。

迄今为止，有些PDN动物模型(如，STZ诱导的大、小鼠PDN模型)已相对比较成熟，但另一些PDN动物模型(如，中国仓鼠、恒河猴等)研究尚处于起步阶段。大多数的遗传或基因修饰的模型[如，C57BL/Ks (db/db)小鼠、STZ诱导的C57BL6/J 模型和 ddY 小鼠、瘦素缺乏的 (ob/ob) 小鼠、NOD小鼠、WBN/Kob大鼠、自发性糖尿病大鼠模型等] 应用较多的领域为PDN发病机理研究，并且某些动物模型(如，L-海藻诱导的神经病变大鼠、OLETF大鼠、基因修饰的SDT大鼠等)在糖尿病及PDN机理研究及药物研发方面已显现出较好的前景[27]，这些模型能准确模拟I型糖尿病引发的PDN，但不能反映人类2型糖尿病并发的PDN[26]，因此，制备出与人类生理病理相似的 PDN模型仍然是该领域研究的热点，也是研发治疗 PDN类药物急需逾越的一道技术鸿沟。

近年来，随着国内非人灵长类动物(NHP)饲养行业的发展，国内已拥有世界范围内最大的NHP动物资源，运用NHP研究人类疾病模型的研究越来越多。非人灵长类动物在生理、病理领域与人类具有高度的相似性，拥有其他动物无法比拟的先天优势，。虽然目前在 PDN方面的研究尚处于起步阶段，但NHP在糖尿病模型的研究中已有较多的报道，而 PDN又是DM的主要并发症之一，因此，运用NHP进行 PDN的研究将会越来越多，运用该类动物制备的 PDN模型能够完全符合前述成模的3个基本条件。此外，由于NHP与人类的高度相似性，它还能为治疗 PDN类药物、抗DM类药物的研发提供十分重要的临床前信息，现已应用于创新治疗方法的测试。

中国现已成为全球最大的灵长类实验动物资源的供应国，且已有多个研究机构在开展糖尿病灵长类动物模型及其并发症研究[4、24]。随着新技术(如，转基因、基因编辑等)在糖尿病及其并发症研究中的应用，相信不久的将来，我国在糖尿病其并发症(如，PDN等)发病机理及创新药物研究领域也将取得突破性进展。

[1] 梁斌, 吴晓云.非人灵长类糖尿病动物模型研究进展[J].动物学研究, 2011(01): 91-96.

[2] O’Brien P D, Sakowski S A, Feldman E L. Mouse models of diabetic neuropathy[J]. ilar J, 2014, 54(3): 259-272.

[3] Boulton A J. The diabetic foot: from art to science. The 18th Camillo Golgi lecture[J]. DIABETOLOGIA, 2004, 47(8): 1 343-1 353.

[4] Wang L, Chopp M, Jia L，etal. Therapeutic Benefit of Extended Thymosin beta4 Treatment Is Independent of Blood Glucose Level in Mice with Diabetic Peripheral Neuropathy[J]. J DIABETES RES, 2015: Article ID 173656, 13 pages.

[5] Obrosova I G, Ilnytska O, Lyzogubov V V，etal. High-fat diet induced neuropathy of pre-diabetes and obesity: effects of“healthy” diet and aldose reductase inhibition[J]. DIABETES, 2007, 56(10): 2 598-2 608.

[6] Sima A A, Zhang W X, Greene D A. Diabetic and hypoglycemic neuropathy--a comparison in the BB rat[J]. Diabetes Res Clin Pract, 1989, 6(4): 279-296.

[7] Rodrigues F O, Fazan V P. Streptozotocin induced diabetes as a model of phrenic nerve neuropathy in rats[J]. J Neurosci Methods, 2006, 151(2): 131-138.

[8] Drel V R, Mashtalir N, Ilnytska O，etal. The leptin-deficient (ob/ob) mouse: a new animal model of peripheral neuropathy of type 2 diabetes and obesity[J]. DIABETES, 2006, 55(12): 3 335-3 343.

[9] Yagihashi S, Wada R, Kamijo M，etal. Peripheral neuropathy in the WBN/Kob rat with chronic pancreatitis and spontaneous diabetes[J]. LAB INVEST, 1993, 68(3): 296-307.

[10] Cornblath D R, Hillman M A, Striffler J S，etal. Peripheral neuropathy in diabetic monkeys[J]. DIABETES, 1989, 38(11): 1 365-1 370.

[11] Kennedy W R, Quick D C, Miyoshi T，etal. Peripheral neurology of the diabetic Chinese hamster[J]. DIABETOLOGIA, 1982, 23(5): 445-451.

[12] Sima A A, Robertson D M. Peripheral neuropathy in the diabetic mutant mouse. An ultrastructural study[J]. LAB INVEST, 1979, 40(6): 627-632.

[13] Rodrigues F O, Fazan V P. Streptozotocin induced diabetes as a model of phrenic nerve neuropathy in rats[J]. J Neurosci Methods, 2006, 151(2): 131-138.

[14] Vareniuk I, Pavlov I A, Obrosova I G. Inducible nitric oxide synthase gene deficiency counteracts multiple manifestations of peripheral neuropathy in a streptozotocin-induced mouse model of diabetes[J]. DIABETOLOGIA, 2008, 51(11): 2 126-2 133.

[15] Murakami T, Iwanaga T, Ogawa Y，etal. Development of sensory neuropathy in streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Brain Behav, 2013, 3(1): 35-41.

[16] Kamenov Z, Higashino H, Todorova M，etal. Physiological characteristics of diabetic neuropathy in sucrose-fed Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2006, 28(1): 13-18.

[17] Serafin A, Molin J, Marquez M，etal. Diabetic neuropathy: electrophysiological and morphological study of peripheral nerve degeneration and regeneration in transgenic mice that express IFNbeta in beta cells[J]. MUSCLE NERVE, 2010, 41(5): 630-641.

[18] Fox A, Eastwood C, Gentry C，etal. Critical evaluation of the streptozotocin model of painful diabetic neuropathy in the rat[J]. PAIN, 1999, 81(3): 307-316.

[19] Kale B, Yuksel F, Celikoz B，etal. Effect of various nerve decompression procedures on the functions of distal limbs in streptozotocin-induced diabetic rats: further optimism in diabetic neuropathy[J]. PLAST RECONSTR SURG, 2003, 111(7): 2 265-2 272.

[20] Muthuraman A, Ramesh M, Sood S. Development of animal model for vasculatic neuropathy: Induction by ischemic-reperfusion in the rat femoral artery[J]. J Neurosci Methods, 2010, 186(2): 215-221.

[21] Hinder L M, Vincent A M, Hayes J M，etal. Apolipoprotein E knockout as the basis for mouse models of dyslipidemia-induced neuropathy[J]. EXP NEUROL, 2013, 239: 102-110.

[22] Yamaguchi T, Sasase T, Mera Y，etal. Diabetic peripheral neuropathy in Spontaneously Diabetic Torii-Lepr(fa) (SDT fatty) rats[J]. J VET MED SCI, 2012, 74(12): 1 669-1 673.

[23] Islam M S. Animal models of diabetic neuropathy: progress since 1960s[J]. J DIABETES RES, 2013,Article ID 149452, 9 pages.

[24] Zeng W, Wen X, Gong L,etal. Establishment and ultrasound characteristics of atherosclerosis in rhesus monkey[J], BioMedical Engineering OnLine，2015, 14(Suppl 1):S13.