鸭新城疫病毒研究进展

陈申秒 ， 程小果 ， 王 慧 ， 何福庆

(山东滨州沃华生物工程有限公司 山东省动物病原微生物工程实验室山东滨州博莱威生物技术研究所 ， 山东 滨州 256600)

新城疫病毒(NDV)的感染宿主范围比较广，因为养殖结构和流行趋势的变化，近些年来鸭群感染才开始引起重视。鸡是NDV的主要宿主，水禽是天然储存库已是共识，然而鸭群对NDV强毒株是否具有坚强的抵抗力，鸭群感染强毒发病和死亡的情况如何？研究各有不同观点。可以肯定的是，NDV出现了某些新的致病特点，在鸭等水禽表现出一定的致病性，鸭群NDV基因型出现新变化[1-2]，系统分析鸭NDV的生物学变化，研究感染宿主之间的关系，总结NDV在宿主范围内的流行和分布形式，对于整个家禽养殖业具有重要的意义。

1 鸭新城疫流行病学调查

有报道的鸭新城疫感染病例和统计数据很多，观点不尽相同。可以肯定的是NDV在感染宿主方面的确发生了很多新的变化，对鸭、鹅等水禽的致病性有明显的增强[2]，水禽通过带毒并经呼吸道和泄殖腔不断排毒，为NDV的不断变异和防控带来一系列的问题。中国又是世界上鸭养殖量最大的国家，占出栏量的70%以上，在国内部分省份养鸭成为主要的养殖产业之一。因此，系统研究水禽，特别是鸭感染NDV在流行病学上有重要的意义。

健康鸭带毒监测是NDV流行病学调查需要非常重视的一环，健康鸭带毒是难以避免的，在应激条件下发病的规律、发病机制、流行特点等需要深入研究。目前的监测机制和数据很不完善，胡北侠等[3]报道了规模化健康肉用种鸭场的监测数据，其监测的健康鸭携带的均属于弱毒株；王珏等[4]对活禽市场和健康家鸭泄殖腔棉拭样品进行了检测，获得23株分离株均符合弱毒F蛋白裂解位点模式，与流行的强毒株和疫苗株遗传距离较远。

然而从感染发病的鸭群中分离NDV并研究其致病性，却是另外一种情况。有学者对我国NDV分子流行病学研究认为，感染并导致水禽发病死亡的NDV主要是基因Ⅶ型和Ⅸ型，又以基因Ⅶ型NDV强毒株占绝对优势[2，5]。问题可能比想象中的复杂，蔡丽丽等[6]从患病鸭分离NDV属于基因Ⅵ型，与鸽源分离毒株亲缘关系近，分析认为由鸽源NDV变异所产生的可能性很大；还有些研究发现，有些基因Ⅶ型NDV毒株对家鸭的致病力并不强，但是人工感染鹅或鸡后却能造成严重的发病和死亡[7]，还有些研究结果显示，基因Ⅶ型NDV强毒株对鸭群并没有明显的致病性。

问题的关键是，我们对于鸭NDV的流行病学调查还太少，报道的健康带毒监测和感染发病的NDV血清型研究还不足以说明鸭NDV的主要问题。我们需要更多的系统数据，特别是规模化养殖区域内的NDV病毒持续监测，从固定的区域、鸭群、系统的养殖周期汇集数据，这样对于系统分析NDV在鸭群的流行病学调查是有意义的，我们应该通过水禽产业体系，建立NDV在水禽育种、养殖、屠宰等环节流行病学监测的数据库，这也是我们开展鸭NDV系统研究的基础。

2 鸭新城疫病毒致病性

NDV 是单股负链、不分节段的RNA 病毒，基因组全长有15 186、15 192 bp和15 198 bp 3种，组编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(NP)、膜蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(F)和大分子蛋白(L)，排列方式为3'-NP-P-M-F-HN-L-5′[8]。目前，关于鸭NDV 的研究主要集中在F、NP 蛋白新型疫苗的开发等方面，而关于其他蛋白在致病性和免疫原性中的作用研究尚不多见。

2.1 鸭新城疫病毒致病性与基因型 NDV只有1个血清型，根据其F基因差异和基因组长度，分为Class I和ClassⅡ两大谱系，ClassI基因组长度为15 198 bp，目前发现共10个基因亚型，主要为低毒力或无毒力毒株，一般由野生和家养水禽携带，没有表现临床感染发病的症状；ClassⅡ基因组长度有15 186 bp和15 192 bp两种，分别包括基因Ⅰ—Ⅳ型和基因Ⅴ—Ⅸ型，包含了低毒、中等毒和强毒株[9]。

目前对NDV分离株的致病性研究集中于MDT、ICPI、IVPI指标和F基因裂解位点氨基酸序列，大部分从发病鸭脑组织中分离的NDV属于强毒株，具有强毒株F基因裂解位点特征的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117，且多属于基因VIId亚型，罗宇宏、翟文栋等[10-12]分别从贵州、河北、山东的不同品种鸭分离的NDV证实了同样的结论。这方面的研究结果并非完全一致，路振香等[13]从鸭脑组织分离的NDV为中等毒力毒株，其1日龄雏鸭脑内致病指数和13日龄鸭胚EID50分别为0.84、10-6.5/0.1 mL；张太翔等[14]在连续多批发病的鸭场分离的NDV分离株具有强毒株特征的F基因裂解位点氨基酸序列，根据高变区氨基酸推导疑似为基因II型。

用强毒特征的NDV分离株接种感染动物验证对鸭的致病性，国内外相关研究结果也存在很多争议。伊惠等[15]用2株鸭源基因Ⅶ强毒株感染鸭和SPF鸡，SPF鸡感染后3～6 d 100%发病死亡，而鸭没有明显的临床症状，国外也有类似报道[16]，Y.Dai[17]等用JSD0812以5×108ELD50剂量通过腿部肌肉注射感染15日龄野鸭(Mallard)后4～6 d试验鸭全部发病死亡，这可能是因毒株的不同特性而导致。

基因型分析对系统掌握鸭NDV流行的诸多方面具有重要意义，由于对NDV的致病性和基因型的研究不够系统，研究结果有很大差异，因此NDV对鸭的致病性存在争议，系统性的研究尚需深入[17]，掌握全球范围内不同宿主NDV流行的总体趋势和演化规律需要更多的NDV基因型的研究信息。然而目前的基因型分析方法受毒株的区域、数量、宿主范围影响很大，不同学者针对所掌握的信息数据进行分型，缺乏系统的、可以全球范围内统一的标准，导致相关研究结果报道的借鉴性大打折扣。因此，笔者认为应该从多个方面开展工作：第一，NDV研究组织应该建立公共的信息平台，将现有的NDV全基因组信息共享；第二，要建立一套以“分值”作为参考标准的分型方法，对影响病毒分型的不同基因、非编码区、关键变异位点等，按照所起的作用权重程度确立“分值”，以分值确立NDV的基因型，并体现NDV演化的可能性来源；此外，对于不同来源NDV的致病性要有相应的参数信息，除了MDT、ICPI、IVPI指标以外，应有将NDV回归感染动物后的信息数据。

2.2 鸭NDV F基因 研究认为，F蛋白对鸭NDV致病性起主要作用[18]，其负责病毒与宿主细胞的融合，其融合能力的强弱，决定了病毒进入宿主细胞复制的能力的强弱，从而决定NDV的毒力。因此，F蛋白裂解位点的氨基酸残基序列作为毒力强弱的判断标准，并根据F基因序列进行基因型分析用于NDV毒力和基因型的研究。

F蛋白以惰性前体Fo形式存在，当转运至高尔基体表面时，位于F蛋白112～117位氨基酸的裂解位点被宿主细胞内的蛋白裂解酶识别，裂解成由二硫键桥联的两个亚单位F1、F2，从而转变为有活性的融合蛋白。因此，112～117位氨基酸顺序与F蛋白的裂解能力与致病力直接相关[2]，有致病性的NDV在细胞培养过程中，F蛋白就能被细胞内蛋白裂解酶裂解。研究发现强毒株FO裂解位点为多个碱性氨基酸的连续排列，而弱毒株为中性氨基酸，这种排列导致了强毒株F蛋白可以被宿主多种组织细胞识别裂解，引发多组织感染，而弱毒株FO被裂解的能力大大降低，感染性很差或者不具有感染力。还有研究认为，强毒株NDV的F1蛋白C端有一对弱毒株没有的二元碱性氨基酸，可以被宿主细胞内普遍存在的蛋白酶识别，比如furin和pc6，无毒力的NDV因为该二元碱性氨基酸的缺失而只能被胰蛋白酶样蛋白酶裂解，引起局部感染[18]。

研究发现F蛋白胞质区位于FO第523～553位氨基酸，第540～550位氨基酸与合胞体的形成十分相关，其位点的改变对病毒形成合胞体的能力起着重要作用；疏水跨膜区位于第500～553位氨基酸残基，主要作用是终止蛋白质转运和膜锚定。孙杰等[12]分析了10株鸭NDV基因Ⅶd强毒株F基因序列，发现流行毒株在52、71、176、272、314、402位和489位出现了比较一致的氨基酸替代，而且具有鹅源NDV所特有的973位和1 249位Rsa I位点，这是需要重视和更多分离株分析验证的问题，在后面的NDV与感染宿主的关系中再详细阐述。张太翔等[14]在连续多批发病的鸭场分离的NDV具有强毒株特征的F基因裂解位点氨基酸序列，然而推导疑似为基因II型， 而在F基因高变区4～121位氨基酸又与基因Ⅱ型不同， 其17位点氨基酸为I，而基因Ⅱ型为V。

NDV毒力的决定因素绝不仅仅限于F基因的差距，这需要更加深入的研究。有研究表明，病毒F蛋白的细胞融合作用需要HN蛋白的辅助作用，且对于HN蛋白有很强的特异性要求，只有F蛋白与同源性HN蛋白共表达，才能够引起细胞融合反应。总体而言，目前对F基因结构功能的研究还太少，对于NDV基因型和致病性的很多研究基于F基因序列的变化，所以对于F基因序列氨基酸的变化、不同宿主NDV的F基因的比较、其他功能蛋白与F蛋白的协同作用机理研究十分关键，这方面无疑需要更为充分的数据。

2.3 HN基因 HN蛋白是一种四聚体寡聚糖蛋白，位于NDV囊膜外表面，具有血球凝集(HA)和神经氨酸酶(NA)活性，也就是兼具识别并结合细胞膜上的唾液酸受体以及破坏这种结合的活性[19]。HN基因开放阅读框长度为1 716 bp，编码571个氨基酸；HN和F基因是NDV基因组中变异最大的，这种改变被认为是造成免疫失败的主要原因，也是目前研究HN基因的重要方面。

HN蛋白只有4个位点能被糖基化(119、341、433位和481位)，这些位点在所有NDV株中是保守的，而HN蛋白上的5个抗原区(191～201、345～353、513～521、494位和569位)及其邻近氨基酸位点(203、342、494～495、508～509、514位和570位) 的变异是最为关键，特别是新近分离株与疫苗株的差异，这种差异会导致NDV与单抗反应性下降，从而出现免疫逃避[20]。罗宇宏等[10]比较其分离株HN蛋白的变化发现，其分离株与基因Ⅶd亚型毒株一致而与疫苗株在抗原区494位和569位以及邻近氨基酸位点发生变异。

HN蛋白第347位氨基酸E-K的变异是近年来NDV毒株的一个新特点，345～353位氨基酸是HN蛋白上的线性表位区，是重要的受体结合区域[21]，段志强等[22]对5株鸭源NDV强毒株的研究发现，HN蛋白功能性氨基酸位点均高度保守，其中3株出现线性表位区E347K的突变。还有其他研究引起鸭群发病的NDV毒株HN蛋白发生了V9M、N323D、E331K和V514I的氨基酸突变，这些突变位点与细胞膜融作用的影响以至于对鸭的致病性的变化需要进一步的研究证实；此外还有研究表明，F-HN和HN-L间隔区序列的长度与病毒致病力有相关性。

目前国内已有构建携带HN基因稳定遗传和表达的重组鸭肠炎病毒，然而这方面的报道还太少。对于HN蛋白的功能研究需要进一步验证，在功能区作用验证的基础上研究这种变化带来的影响，以及验证与其他蛋白的协同作用，是对NDV防控的重要基础研究。

2.4 NP蛋白 NP蛋白是由489个氨基酸残基组成的单股多肽，是鸭NDV核衣壳结构蛋白的主要成分，是病毒粒子中含量最丰富的蛋白，其N端结合RNA，高度保守，C端含有磷酸化位点和抗原决定簇位点。由于毒株间NP基因高度保守，且具有很好的免疫原性，可诱导机体产生抗体，用于新城疫的临床诊断和疫苗免疫监测。

研究认为，NP基因的tuRNA的合成对NDV的转录、复制是必要的，但是对NP蛋白的研究并不深入。有报道以NP蛋白为免疫原，获得2株杂交瘤细胞株，均可以识别NP蛋白的线性表位，MAb为IgG1型抗体的杂交瘤细胞株能与NP蛋白发生特异性反应，而分泌MAb为IgM型抗体的杂交瘤细胞株却不能[23]。因此，针对NP蛋白制备的单克隆抗体(MAb)特点的需要更多的研究，用MAb建立ELISA方法的应用需要更多的数据验证；同时NP蛋白不具有免疫保护作用，这对于我们从多个方面更为有效评价NDV的免疫效果提出要求。

2.5 其他基因 P基因转录的病毒mRNA编码P、V和W 3种蛋白，在NDV感染过程中分别占68%、29%和2%，V蛋白和W蛋白虽然表达量不高，但在病毒的复制中发挥着不可替代的作用。V蛋白和W蛋白通过P基因在编辑过程中非模版G的插入，产生阅读框位移+1和+2的mRNA而编码，因此3种蛋白具有共同的N端部分和不同的C端部分[24]，这种结构使其需要3种抗体区分其表达，而且mRNA的表达不稳定性使各种基因型NDV表达的V蛋白和W蛋白氨基酸同源性低，从而难以获得适用的检测抗体，为V蛋白和W蛋白功能的研究带来很大难度。

已有研究证实，麻疹病毒等副黏病毒的V蛋白具有介导病毒免疫逃逸的功能，在IFN信号抑制、双链RNA信号抑制、凋亡抑制等方面发挥作用[25]。对NDV蛋白的研究证实了V蛋白是一种毒力因子，通过干扰IFN信号通路，拮抗宿主的抗病毒反应，对病毒在细胞内的复制和致病性发挥重要作用。研究认为，V蛋白的C端结构域(CTD)介导了抗IFN活性，该区域为保守的半胱氨酸富集区，通过近年来的研究发现，NDV不同毒株的CTD氨基酸同源性差异很大[26]。此外还有研究发现，V蛋白的不同与毒株的宿主嗜性有一定关系，傅强等[27]报道不同NDV毒株V蛋白多克隆抗体在不同宿主细胞中的表达差异很大，宿主细胞对V蛋白的抑制，与NDV对细胞的噬性和感染能力有很大关系。

M蛋白位于病毒囊膜内侧面，是构成囊膜的支架的组成部分，在病毒的装配中、调节RNA 合成、抑制宿主细胞的免疫反应等发挥作用[28]；有研究发现，基因起始、终止、基因间隔区完全相同，NP、P、M、F高度相似的NDV强毒株和疫苗株，差异集中于HN和L蛋白上。Subrat等(2008)用反向遗传技术将强毒株替换为疫苗株LaSota的L基因，获得的重组NDV病毒繁殖速度及致病性显著高于替换前的强毒株。

3 鸭NDV与感染宿主之间的关系

我们最为关注的应当是NDV的与宿主之间关系的变化，虽然流行病学数据显示NDV在鸭群中的发病率上升，分子生物学显示了基因VIId亚型在鸭群中的优势，我们还是要从更多的报道中梳理NDV与宿主之间的关系，并以此找到有效阻断NDV流行的方法。普遍的观点认为，水禽陆禽的双向传播和混合饲养是NDV难以防控的关键，鸭等水禽是NDV产生高致病性的重要环节，其长期带毒、排毒为NDV提供了生存空间，病毒和宿主细胞之间的博弈改变着NDV的分子生物学结构，并通过改变获得逃避免疫的能力。

目前对于不同NDV分离株在鸭、鸡群中的致病性研究基本一致，NDV强毒株对鸡具有很高的致病性并在鸡体呼吸、消化系统等多种组织器官中增殖并引起各种组织损伤，而在鸭体内只是局限在几个内脏组织内复制并不具备致病性；来源于鸡和鸭的强毒NDV分离株对雏鸡的致病性都非常高，而鸡源分离株对雏鸭的致病性显著高于鸭源分离株，很多毒株对鸭感染性低或无症状感染[29-30]。对这种致病性差异，普遍认为鸭源分离株是适应了鸭体内免疫系统而能在其体内存活，当传播到鸡体内时，又具备了感染性。Otim等研究发现，从鸭体内分离的NDV强毒株可以感染鸡并使鸡群产生高致死率；于圣青等[18]研究发现，野生水禽中无毒力的毒株在鸡群中传播时，变为高致病性毒株，这种变化是随着不断地传代逐渐发生的，至第9代时，380位和392位发生两个G-A突变，第112位和115位裂解位点发生Gly-Lys的变异，产生二元碱性氨基酸，从而完成F基因裂解序列由E-R-Q-E-R/L变为K-R-Q-K-R/F的变化。其他对鸡源、鸭源病毒F蛋白氨基酸变异的研究也验证了这种致病性的变化。

对感染组织的研究认为，脑组织是决定NDV致病性的最重要器官，通过脑内传代引起F基因核苷酸的第397位点G-T的变化，导致F蛋白第117位点Leu-Phe的变化，研究发现，这种Fl蛋白N端的氨基酸变化会阻断细胞内蛋白酶的裂解反应，从而发生致病性的改变。对NDV连续传代研究发现，弱毒株经脑内传代后，变成高致病性病毒。总体而言，我们仍缺乏鸭NDV在规模化养殖中自然感染的数据，缺乏在鸭、鸡两种主要宿主之间的迁移规律方面的信息，鸭源NDV对鸡群的致病性和鸡源NDV对鸭群的致病性之间的关系需要更多的验证，我们应当从NDV的感染机制与宿主细胞之间的关系上探索。

在宿主和NDV之间的关系研究任重道远，显然鸭、鹅、鸡具有先天性免疫基因的差异，鸭等水禽细胞具备抵抗NDV早期感染的能力，然而近年来发生的水禽感染率升高的原因亟待探索，有研究认为，鸟类是这种宿主转变的媒介，由鸟类传染到水禽的NDV发生15 186-15 192 nt的转变和F基因101位K和121位V的变异，从而导致宿主致病性的变化，这种可能性需要进一步的研究证实。水禽与鸡群使用同类疫苗免疫是否导致健康带毒鸭群NDV发生变化，从而出现致病性的变化，还是鸟类等宿主的媒介作用，都需要更多的数据和研究证实。

4 鸭NDV研究重点与防治前景

虽然没有证据证实高致病性毒株源于活疫苗的使用，但是对于无致病性NDV毒株的传代发生的基因层面的变异以及致病力的变化，必须高度重视。F裂解位点突变株导致致病性变化以外，经脑组织传代而F裂解位点并未发生改变的情况下，也可以出现致病性的增强；病毒在感染靶动物体内的增殖会不断增加其致病力，甚至出现超强毒株，这对于副黏病毒来说并非难事。因此我们对于NDV的防治要重新考虑，特别是在水禽养殖中的免疫要系统考虑，一方面要保证鸭等水禽具有对NDV的抵抗力，选用适用于水禽的NDV毒株，使水禽不再成为储存和改造病毒的基地；另一方面对于鸭群排毒的监测要加强，特别是监测鸭群排毒、鸡群感染分离株、疫苗株的比较，对新城疫活疫苗的要特别加强标记和监测。

NDV免疫的减负势在必行，为追求免疫效果，商品代鸡场，特别是商品代蛋鸡场频繁、高剂量免疫ND疫苗。而目前ND疫苗株与流行株抗原性差异造成了诸多问题，大量鸡群处于高ND抗体水平，但持续向环境排毒[31]，当环境当中的病毒量达到一定程度以后，又出现非典型症状，然后再通过免疫提升抗体维持稳定，因此，必须筛选与流行株的抗原性一致的毒株，使鸡群维持在合理的抗体水平，并有效降低排毒量。

前文已叙述基因型分析存在的问题，对于NDV的免疫评价，更多的应当回归到传染病和免疫学研究的基本原理，充分开展疫苗毒株的抗原性研究，应当改变单纯特异性免疫产生抗体水平的评价标准，转变为非特异性免疫的监测、排毒的监测等多个方面的考虑，用大量的临床数据证实，并归入新兽药质量标准的审批中。

既然鸭对于NDV具有天然的抗感染能力，在宿主细胞与NDV感染机制之间的研究需要更多的关注。从分子生物学的角度，研究水禽对于NDV先天性免疫基因的功能机制，利用基因标记、反向遗传技术揭示宿主细胞与NDV感染过程中关键基因的变化，以至于对于基因型的影响和宿主亲嗜性的变化，综合系统性的数据分析揭示不同宿主之间NDV的内在关系，才能从根本上制定防控NDV的综合措施。

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