TGF-β1通过F-actin聚合促进乳腺癌细胞MCF-7发生上皮-间质转化

孙志亮，李洪利，尹崇高

(潍坊医学院 1.生物科学与技术学院、2.医学研究实验中心、3.护理学院，山东 潍坊 261053)

TGF-β1通过F-actin聚合促进乳腺癌细胞MCF-7发生上皮-间质转化

孙志亮1，李洪利2，尹崇高3

(潍坊医学院 1.生物科学与技术学院、2.医学研究实验中心、3.护理学院，山东 潍坊 261053)

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞失去极性，获得间质形态的一个过程[1]。肿瘤细胞中，EMT的激活促进了肿瘤的侵袭转移。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 属于TGF家族，它能够调节细胞增殖、分化、细胞凋亡及细胞外基质的生成等[2]。在生理和病理状态下，TGF-β1都是EMT发生的主要诱导因子之一。本文通过TGF-β1诱导乳腺癌细胞MCF-7，检测细胞中EMT相关蛋白vimentin、E-cadherin的表达，F-actin的聚合情况以及LIMK、cofilin的磷酸化水平，进一步阐明TGF-β1促进乳腺癌细胞MCF-7 EMT的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 TGF-β1购自Peprotech公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人E-cadherin单克隆抗体、鼠抗人vimentin单克隆抗体均购自Santa Cruz；兔抗人p-LIMK单克隆抗体、兔抗人LIMK单克隆抗体、兔抗人p-cofilin单克隆抗体、 兔抗人cofilin单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology；鬼笔环肽购自eBioscience；胎牛血清和MEM培养液购自美国Hyclone公司；人乳腺癌细胞系MCF-7购自美国ATCC细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7培养在含10%的胎牛血清、青链霉素的MEM培养基中，置于含5% CO2、37℃的培养箱中传代培养。采用对数期细胞铺到6孔板中，待其长到70%左右时弃去培养液，加入无血清的MEM培养基饥饿12 h后。将人乳腺癌细胞系MCF-7分组：A组细胞不加TGF-β1，作为阴性对照；B组细胞用TGF-β1进行诱导刺激。以时间梯度24、48、72 h进行诱导刺激。

1.2.2 Transwell侵袭实验 按文献[3]的步骤进行操作。在光学显微镜下随机选取5个视野， 对穿到人工基膜底部的细胞进行观察计数。每个实验独立重复3次，取平均数作为最终实验结果。

1.2.3 F-actin聚合实验 将A、B两组细胞的悬浊液铺在激光共聚焦培养皿中，培养72 h后，用4%的多聚甲醛固定。PBS清洗，加入1% 的BSA进行封闭。封闭20 min后，加入phalloidin(1 ∶50)于37℃孵育箱中孵育1 h。PBS清洗，随后加入DAPI染核，染核20 min后，加入抗淬灭剂封片。

1.2.4 Western blot 细胞提取总蛋白，以等量蛋白上样到12%的SDS-PAGE中进行电泳，电泳后蛋白分离并转到PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h。TBST洗膜后，加入化学发光剂ECL，X线胶片曝光。

2 结果

2.1 TGF-β1促进MCF-7细胞发生EMT Western blot 结果显示，在用TGF-β1诱导的时间梯度24、48、72 h中，刺激时间在72 h发生EMT最为明显。乳腺癌细胞MCF-7中E-cadherin蛋白水平下调，而vimentin蛋白水平上调(P<0.05)。

2.2 TGF-β1促进了乳腺癌细胞MCF-7的侵袭 Transwell侵袭结果显示，用TGF-β1诱导72 h的MCF-7细胞，其穿到滤膜底部的细胞数明显多于未用TGF-β1诱导的细胞数，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 TGF-β1诱导MCF-7细胞发生EMT后F-actin聚合作用的变化情况 免疫荧光检测F-actin 聚合的变化结果显示，在用TGF-β1诱导72 h后， TGF-β1诱导的乳腺癌细胞MCF-7中F-actin 的聚合作用比未诱导的乳腺癌细胞MCF-7明显增加(P<0.05 )。

2.4 TGF-β1促进了MCF-7细胞中LIMK和cofilin的磷酸化 检测了LIMK和cofilin的磷酸化水平。结果显示，用TGF-β1诱导72 h后，LIMK和cofilin的磷酸化明显增加 (P<0.05 )。

3 讨论

肌动蛋白解聚因子丝切蛋白家系(ADF/cofilin)是一种肌动蛋白结合蛋白，它能够切割F-actin，加快F-actin的解聚[4]。cofilin通过调节肌动蛋白骨架的重塑，对肌动蛋白相关细胞活动具有重要作用[5-6]。LIMK是cofilin的上游信号分子，通过磷酸化cofilin氨基端第3位丝氨酸(Ser-3)使得cofilin失去解聚肌动蛋白的能力，提高F-actin的稳定性。F-actin 的聚合与解聚合与肿瘤的侵袭转移密切相关。研究发现，F-actin的解聚使得RhoA失活，促进EMT相关转录因子Snail和Smad1/2/3由细胞核向细胞质转移，发生EMT的逆转[7]。

本研究发现，TGF-β1在诱导MCF-7发生EMT的过程中p-LIMK、p-cofilin的表达明显增强， F-actin的聚合明显增加。E-cadherin蛋白水平下调，而vimentin蛋白水平上调。结果证实TGF-β1可以通过LIMK/cofilin信号通路影响F-actin的聚合，促使EMT的发生，阐述了TGF-β1促进EMT的发生机制，为抑制乳腺癌的侵袭转移以及提高乳腺癌患者的生存率提供了理论依据。

[1] Song Q, Xu Y, Yang C, et al. miR-483-5p promotes invasion and metastasis of lung adenocarcinoma by targeting RhoGDI1 and ALCAM[J].CancerRes， 2014, 74(11): 3031-42.

[2] Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H, et al. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) in physiology and pathology[J].EndokrynolPol， 2013, 64(5): 384-96.

[3] 田红艳, 陈萍萍, 李 笑, 等. Gab2通过PI3K/Akt/ARK5/MMP途径影响乳腺癌的侵袭和转移[J].中国药理学通报， 2015, 31(7): 1014-8.

[3] Tian H Y, Chen P P, Li X , et al. Gab2 effects the invasion and metastasis of breast carcinoma through PI3K/Akt/ARK5/MMP signal pathway[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(7):1014-8.

[4] Kanellos G, Frame M C. Cellular functions of the ADF/cofilin family at a glance[J].JCellSci， 2016, 129(17): 3211-8.

[5] Bravo-Cordero J J, Magalhaes M A, Eddy R J, et al. Functions of cofilin in cell locomotion and invasion[J].NatRevMolCellBiol， 2013, 14(7): 405-15.

[6] Mizuno K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation[J].CellSignal， 2013, 25(2): 457-69.

[7] Shankar J, Nabi I R. Actin cytoskeleton regulation of epithelial-mesenchymal transition in metastatic cancer cells[J].PLoSOne， 2015, 10(7): e0132759.

TGF-β1 promotes epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cell line MCF-7 through F-actin polymerization

SUN Zhi-liang1, LI Hong-li2, YIN Chong-gao3

(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology, 2.MedicineResearchCenter, 3.CollegeofNursing,WeifangMedicalUniversity,WeifangShandong261053,China)

TGF-β1；上皮-间质转化；肌动蛋白丝聚合；LIM激酶；肌动蛋白解聚因子；乳腺癌

TGF-β1; EMT; F-actin polymerization; LIMK; cofilin; breast cancer

2017-01-22，

2017-02-27

国家自然科学基金青年基金项目(No 81402389)；山东省自然科学基金资助项目(No ZR2015HL065)；山东省高等学校科技计划(No J12LK03，J13LK03)；国家级大学生创新训练计划项目(No 201510438011)；潍坊医学院大学生科技创新基金资助项目(No KX2015012)

孙志亮(1995-)，男，学士，研究方向：肿瘤病理学，E-mail：szlwfmcswjs@163.com； 李洪利(1977-)，女，硕士，副教授，研究方向：肿瘤病理学，通讯作者，E-mail：ycglihongli@163.com

时间：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.056.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.028

A

1001-1978(2017)05-0735-02

R329.24；R341；R737.902.2；R977.6