甲氨蝶呤遗传药理学的研究进展

鄢 欢，张 觅，蒋巧俐，程 虹（武汉大学中南医院临床药学室，武汉 430000）

甲氨蝶呤遗传药理学的研究进展

鄢 欢＊，张 觅，蒋巧俐，程 虹（武汉大学中南医院临床药学室，武汉 430000）

目的：了解甲氨蝶呤（MTX）的遗传药理学研究进展。方法：查阅近年来国内外相关文献，就MTX遗传药理学的研究进展进行归纳和总结。结果与结论：MTX不能自由跨过细胞膜，须借助还原性叶酸载体1进入胞内发挥药理作用；细胞上的三磷酸腺苷结合盒转运体可将进入胞内的MTX转出细胞；有机阴离子转运肽介导两亲性物质的摄取，上述转运体基因多态性会影响MTX的疗效。多聚谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰水解酶、二氢叶酸还原酶、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、胸苷酸合成酶、5-氨基咪唑-4-甲酰胺-核苷酸甲酰转移酶、蛋氨酸合成酶和蛋氨酸合成还原酶等的基因多态性会直接影响MTX的代谢、疗效和不良反应。目前能够用于临床的基因多态性位点仅为MTHFR 677C＞T和MTHFR 1298A＞C，可通过筛查其单核苷酸基因多态性来指导非霍奇金淋巴瘤患者的大剂量MTX化疗。MTX的作用受多种基因及其相互作用调控，可能还存在种族等其他因素作用，需对与MTX相关的基因多态性位点进行更深入的综合研究。

甲氨蝶呤；基因多态性；二氢叶酸还原酶；亚甲基四氢叶酸还原酶；遗传药理学

甲氨蝶呤（MTX）是一种叶酸拮抗药，临床常用于白血病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病的治疗。二价的MTX阴离子通过细胞表面的还原性叶酸载体1（RFC1，也称SLC19A1）进入细胞，转入胞内的MTX在多聚谷氨酰胺合成酶（FPGS）的催化下形成MTX多聚谷氨酸聚合物（MTX-PGs）并在细胞内发挥作用。同时，MTX-PGs可被γ-谷氨酰水解酶（GGH）水解为MTX单体。MTX的药理活性主要取决于其胞内浓度，其主要的靶向目标为二氢叶酸（DHF）还原酶（DHFR）、胸苷酸合成酶（TS）和5-氨基咪唑-4-甲酰胺-核苷酸甲酰转移酶（ATIC）。MTX抑制DHFR，致DHF无法还原成四氢叶酸（THF），使嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成受到阻滞。胞内的MTX可被细胞表面的三磷酸腺苷（ATP）结合盒转运蛋白[如多药耐药蛋白（MRP）、乳癌耐药蛋白（BCRP）和P糖蛋白（P-gp）]转运出细胞，导致其胞内浓度降低[1]。MTX的转运在某些组织中还和有机阴离子转运肽（OATP）有关。临床给予不同患者同等剂量MTX后，患者消除相血药浓度个体差异大，耐受性和不良反应也有差异。与上述通路有关的基因遗传多态性会直接影响MTX的代谢、疗效和毒性[2]，导致MTX临床治疗中明显的个体差异。鉴于此，笔者查阅近年来国内外相关文献，就MTX遗传药理学的研究进展进行归纳和总结，以期为其安全、有效的临床应用提供参考。

1 转运体

1.1 RFC1

MTX不能自由跨过细胞膜，须借助RFC1进入胞内发挥药理作用。RFC1基因位于第21号染色体，唐氏综合征患者体内RFC1水平较高，故同等剂量的MTX在其体内发生药品不良反应的几率比在正常人群中大[3]。与MTX相关性最大的RFC1突变是27位组氨酸和精氨酸（80G＞A）的替换，组氨酸替换精氨酸后导致受体亲和力下降，影响MTX的跨膜转运。A等位基因可使MTX跨膜转运量减少，导致血液中MTX浓度升高，引起药品不良反应。同时，A等位基因携带者MTX化疗后感染和胃肠毒性的风险增加，而MTX化疗后发生肝毒性和呕吐则与G等位基因有关[4]。Gregers J等[5]的研究纳入186例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者，对患者基因分型发现RFC1AA基因型患者给予大剂量MTX化疗后骨髓毒性的发生率高于RFC1 GG或RFC1 GA基因型患者，但对RFC1 GG基因型患者的肝毒性更严重。国内研究结果也发现，RFC1 80G＞A基因型与大剂量MTX化疗的不良反应有关，王捷等[6]的研究显示，RFC1 GG基因型患者较RFC1AA基因型患者MTX化疗后血小板下降更明显；RFC1 AG和RFC1 GG基因型患者较RFC1 AA型患者MTX化疗后丙氨酸转氨酶升高更明显；RFC1 AG和RFC1 GG基因型患者发生肝功能损伤的频率较RFC1 AA型高。Shimasaki N等[7]的研究观察ALL患者RFC1基因多态性与MTX维持化疗毒性的相关性时发现，RFC1 80G＞A基因与其治疗毒性相关。Leyva-Vazquez MA等[8]的研究发现，RFC1位点基因突变还与ALL患者MTX化疗后的生存率和复发率相关，RFC1 GA和RFC1AA基因型患者生存率较低且复发率较高。

1.2 ATP结合盒转运体

细胞上的ATP结合盒转运体可将进入胞内的MTX转出细胞，MRP和BCRP的表达增强可导致患者对MTX产生耐药性。MRP2介导胆汁中葡糖苷酸胆红素向胆汁中排泄，MRP2存在于正常的近端肾小管刷状缘细胞膜上，与MTX的代谢有关[9]。Vlaming ML等[10]的研究采用MRP2和MRP3基因敲除鼠观察这2个转运蛋白对MTX和7-OH-MTX体内消除的影响，结果发现MRP2基因敲除鼠MTX在血液中的浓度-时间曲线下面积（AUC）是野生型基因组的2倍，7-OH-MTX在血液中的AUC是野生型基因组的6倍，MTX的胆汁排泄率则比野生型基因组降低27%，7-OH-MTX的胆汁排泄率比野生型基因组降低83%，进一步证明了ATP结合盒转运蛋白和MTX的代谢相关。目前，临床研究的与MTX相关MRP2基因突变位点主要为1271A＞G、－24C＞T和IVS 23+56 T＞C。其中，1271A＞G基因突变导致MRP2的转运功能丧失，使MTX的半衰期由5.0～15.0 h延长至29.3 h，引起不可逆的肾毒性[11]；－24C＞T的表达量具有性别选择性，且与MTX的血药浓度相关，携带有T等位基因的女性患者给予MTX化疗时，其血药浓度是AA基因型女性患者的2倍，故需要高剂量的亚叶酸进行解救才能缓解MTX的毒性反应[12]；携带IVS 23+56 T＞C突变基因的高加索人群给予MTX治疗类风湿性关节炎（RA）时，其脱发和胃肠毒性的发生率高于野生型和杂合型患者[13]。也有学者探究了P-gp 3435C＞T基因突变对MTX的影响，但研究结果尚存在争议。P-gp 3435C＞T基因突变不会改变蛋白质序列，但会使P-gp的表达量减少，P-gp 3435C＞T基因多态性与ALL患儿血清MTX浓度和化疗毒性无关。然而，Hoffmeyer S等[14]的研究发现3435C＞T基因突变导致P-gp在小肠的表达量减少，致MTX的生物利用度改变。Kim IW等[15]研究显示干细胞移植后P-gp 3435C/T的表达量减少。王淑梅等[16]研究基因多态性对MTX的群体药动学的影响时发现，CC和CT基因型患者MTX的清除率均显著高于TT基因型患者。

1.3 OATP（SLCO基因）

OATP广泛分布于肝、肾、肠细胞和血管内皮细胞，介导两亲性物质的摄取。MTX是OATP1A2、OATP1B1和OATP1B3的底物，故OATP基因多态性是MTX治疗产生个体差异的原因。Badagnani I等[17]的研究检测了OATP1A2在不同人种之间的12种蛋白质变异，发现Ile13Thr（38T/C）、Arg168Cys（502C/T）、Glu172Asp（516A/C）和Asn278Del（833A）基因突变会影响MTX转运，携带38CC等位基因的美国人群MTX转运率较不携带该等位基因的人群增加了2倍，且MTX在肾末端小管的重吸收明显增加，但MTX的全身性毒性也增加。携带516CC等位基因的患者MTX的吸收率较携带38CC等位基因的患者降低40%，MTX的重吸收减少，导致其在远曲小管蓄积形成结晶尿，产生肾毒性。Lopez-Lopez E等[18]的研究探讨ALL患儿OATP1B1基因多态性与MTX化疗毒性的相关性，结果显示rs11045879 CC基因型患者MTX血药浓度较高，且该基因突变与MTX清除率和毒性相关。rs4149081和rs4149056基因多态性也与MTX清除率和巩固治疗的毒性有关，rs4149056基因的该项作用弱于前两个基因位点。

2 酶

2.1 FPGS和GGH

FPGS和GGH催化MTX的多聚谷氨酰基化及其解离，因此细胞内的MTX-PGs的浓度由FPGS和GGH的活性决定。MTX-PGs的多聚谷氨酰长度与其在细胞内的停留时间和MTX与靶分子的亲和性有关。赵霞等[19]的研究表明，FPGS的活性降低是肿瘤细胞对MTX产生耐药的原因之一；mRNA剪切过程中的突变也可导致FPGS失活，对MTX产生耐药。FPGS的基因多态性可以影响癌症患者MTX化疗疗效，但还需进一步的临床研究加以证实。

GGH可将MTX-PGs水解为MTX单体，促使MTX转出细胞。目前，研究得比较多的GGH基因突变位点主要为452C＞T和401C＞T。452C＞T基因位于GGH基因的5号外显子，突变基因使苏氨酸被异亮氨酸取代，导致GGH活性下降，使MTX-PGs在细胞内蓄积，增加MTX的细胞毒性[20]。Ranganathan P[21]的研究显示，452T等位基因与MTX化疗后Ⅱ度血小板减少的发生率相关。401C＞T基因突变则能增强GGH活性，加速MTXPGs的分解。携带有401CT和CC基因的RA患者MTX-PGs浓度是TT基因型患者的4.8倍。此外，Koomdee N等[22]的研究还发现，401CT和CC基因会增加MTX化疗后产生血小板和白细胞减少（Ⅲ～Ⅳ级）的风险。

2.2 DHFR和亚甲基THF还原酶（MTHFR）

DHFR是MTX的作用靶点之一，MTX抑制其活性，使核苷酸合成受阻最终导致细胞凋亡。Goto Y等[23]于2001年首次发现DHFR 829C＞T的T等位基因能增加DHF的表达。Mishra PJ等[24]的研究表明，携带DHFR 829T等位基因的白血病患儿DHFR的mRNA表达上调，对MTX的耐药性增强。Gomez-Gomez Y等[25]的研究发现，携带DHFR 829T等位基因的ALL患儿给予MTX化疗后，其生存率较低，且复发风险较携带DHFR 829A等位基因的患者增加14倍。Koomdee N等[22]的研究表明，DHFR 829A等位基因与ALL患儿MTX化疗毒性不存在相关性。另一个研究得比较多的DHF基因多态性位点是317A/G。Milic V等[26]的研究观察DHF基因与RA患者对MTX的应答时发现，携带AA等位基因的患者对MTX的应答较差。DHF基因位点也与ALL患儿MTX化疗后的生存率和复发率有关。此外，DHFR基因19 bp缺失也是目前的一项研究热点。DHFR基因的缺失导致DHFR mRNA表达量改变，血浆叶酸浓度下降，半胱氨酸浓度升高。OngaroA等[27]的研究发现，19 bp杂合型的ALL患者给予MTX化疗后肝毒性发生率比野生型基因患者增加2.07倍，纯合型患者肝毒性发生率则比野生型增加4.57倍。

MTHFR基因位于1p36.3，整个编码区长1 980 bp，包含11个外显子和10个内含子，可催化叶酸循环中的5，10-亚甲基THF转化为5-甲基THF，可维持细胞内叶酸平衡。学者们在MTHFR基因上发现了至少15个基因多态性位点，研究主要集中在677C＞T和1298A＞C。其中，677C/T基因突变导致MTHFR 667位丙氨酸被缬氨酸替代，MTHFR的活性降低，使细胞内同型半胱氨酸的浓度升高，叶酸分布发生改变。与野生型（CC基因）相比，MTHFR 677CT基因型MTHFR活性降低30%，MTHFR 677TT基因型MTHFR活性降低60%。MTHFR基因多态性与MTX的不良反应密切相关。El-Khodary NM等[28]对MTHFR基因多态性和大剂量MTX化疗的不良反应的相关性进行了较全面的研究，结果显示携带MTHFR 677TT和CT基因的ALL患儿血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和胆红素的浓度明显高于CC基因型患儿，可见MTHFR 677T基因突变导致MTX化疗肝毒性增加；携带MTHFR 677TT和CT基因的患儿血清α 1-微球蛋白和肌酐含量也较高，肾小球滤过率明显降低，可见MTHFR 677T基因突变也导致MTX化疗肾毒性增加；该研究还发现，MTHFR 677T基因会导致MTX化疗后机体的血液、肠胃和中枢神经系统毒性增加。D’Angelo V等[29]的研究显示，MTHFR 677T基因携带者的MTX化疗毒性较不携带者增加12倍，且MTHFR 677CT基因多态性还与MTX化疗RA的不良发应相关，其T等位基因增加了不良反应发生率。MTHFR 1298A碱基被C碱基替换后，改变429位密码子，使MTHFR 429位谷氨酸被丙氨酸替代，MTHFR活性降低。携带MTHFR 1298AA基因型的ALL患者使用大剂量的MTX化疗的毒副作用大于携带突变基因型（AC+CC）的患者，且其骨髓抑制、消化道症状、黏膜损害和肝损害的发生率均较大。携带MTHFR 677TT基因型同时携带MTHFR 1298AA基因型者毒副反应发生率最高，是MTHFR 677CC基因型同时携带MTHFR 1298TT基因者的16.5倍，可见两种基因型联合可极大地降低酶活性[30]，使MTX的对细胞的毒性增加。

2.3 TS和ATIC

TS是核苷生物合成的关键酶，可催化脱氧尿嘧啶核苷酸（d-UMP）转化为脱氧胸腺嘧啶核苷（d-TMP），而d-TMP是体内嘧啶合成的唯一原料。TS活性或数量降低均会导致碱基错配率增加，DNA合成受阻。TS基因5′-非翻译区（5′-UTR）含有可变的串联重复序列，该串联重复区域有类似增强子的功能，该序列有2～9次重复（TS 2R～TS 9R）的多态性，其中最常见的基因型为TS 3R/3R、TS 3R/2R、TS 2R/2R，重复序列能增加TS mRNA表达和酶活性，如3R的mRNA表达较2R增加2.6倍，从而对MTX产生影响。Dervieux T等[31]的研究发现，MTX对TS 2R/2R基因携带者的疗效较好。Bohanec GP等[32]对213例类RA患者5′-UTR基因多态性的研究也发现，TS 2R/2R基因携带者疾病活动度较低，较低剂量的MTX即可产生较好疗效；TS 3R/3R基因携带者产生MTX诱导的骨髓毒性风险较高。此外，TS 3′-UTR的1 494 bp处存在6 bp TTAAAG核苷酸片段缺失或插入多态性，而6 bp基因缺失使mRNA稳定性下降，TS表达量下降。Kumagai K等[33]的研究表明，3′-UTR 6 bp等位基因缺失者的MTX疗效较未缺失者更加显著（P＝0.033）；以C反应蛋白（CRP）作为MTX治疗RA疗效评价指标，6 bp等位基因缺失者CRP水平改善程度较未缺失者更明显（P＝0.024）。

ATIC主要与MTX的抗炎作用有关，MTX作用于ATIC，减少腺苷和腺苷酸的分解，使其细胞内浓度增加，腺苷酸脱磷酸后使细胞外腺苷浓度增加，从而发挥抗炎效应。ATIC基因位于2q35，ATIC 347CG多态性致密码子116苏氨酸替换为丝氨酸，其基因突变后会影响MTX对RA患者的疗效。Dervieux T等[33]研究108例RA患者ATIC基因多态性与服用MTX（3个月）后疗效的相关性时发现，MTX对携带ATIC 347GG基因型的患者疗效较好。Weisman MH等[34]的研究发现，ATIC 347GG基因与MTX治疗RA的胃肠道副反应相关。但是，Wessels JA等[35]的研究则发现，携带ATIC 347CC基因的RA患者服用MTX的疗效比携带ATIC 347TT的患者好。因此，ATIC基因多态性与MTX疗效的关系还需进一步论证。

2.4 蛋氨酸合成酶（MTR）和蛋氨酸合成还原酶（MTRR）

MTR是叶酸代谢途径中的关键酶，参与一碳单位的代谢，影响核酸的合成，其参与的蛋氨酸循环是体内腺苷来源之一。MTRR是MTR的辅助因子，可催化甲基钴胺再生，间接参与体内甲基化过程。MTR A2756G和MTRR A66G基因变异可能影响酶的活性，并影响MTX的药效。Gemmati D等[36]的研究纳入120例非霍奇金淋巴瘤患者，对其MTHFR 677C＞T和MTRR 66A＞G基因多态性研究时发现，同时携带有MTHFR 677TT和MTHFR 66GG基因型的患者，细胞增殖的时间是其他基因型患者的4.2倍。Dervieux T等[37]的研究表明，MTR和MTRR的基因突变与MTX疗效无相关性，但和不良反应相关，携带MTR 2756AA或MTRR 66GG的患者胃肠道不良反应发生率较携带其他基因型患者高。Berkun Y等[38]的研究也认为，MTR基因变异与MTX的不良反应相关，携带MTR 2756GG基因型患者更容易出现MTX诱导的风湿性结节。

3 结语

患者的基因多态性会导致MTX的疗效和不良反应发生个体差异，MTX遗传药理学研究的最终目标是通过对患者靶基因的筛查，制订个体化给药法案，提高MTX疗效，降低其不良反应发生率。由于研究标准（如种族、体内叶酸水平和入组标准等）不一致，MTX遗传药理学研究仍然存在一些争议，且基因多态性（如RFC1 80GA、DHFR 19 bp缺失、ATIC 347C＞G、MRP2 1271A＞G）的研究大多是体外研究，临床研究相对较少。目前，能够用于临床的基因多态性位点仅为MTHFR 677C＞T和MTHFR 1298A＞C，可通过筛查其单核苷酸基因多态性来指导非霍奇金淋巴瘤患者的大剂量MTX化疗。此外，MTX的作用不可能仅受单基因因素影响，而是受多种基因及其相互作用调控，可能还存在种族等其他因素作用。因此，需对与MTX相关的基因多态性位点进行更深入的综合研究，提高MTX遗传药理学的临床价值，达到精准医疗的目的。

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（编辑：陶婷婷）

R968

A

1001-0408（2017）02-0284-05

2016-04-07

2016-11-21）

＊药师，硕士。研究方向：临床药学。电话：027-67813199。E-mail：sqcda@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.02.39