老年慢性乙型肝炎患者用药治疗后乙肝病毒耐药基因多位点变异

赵 帅 孙静娜 代丽丽 李彦明 单保恩 耿玉兰 魏从真

(河北医科大学第一医院检验科，河北 石家庄 050031)

·消化、呼吸系统疾病·

老年慢性乙型肝炎患者用药治疗后乙肝病毒耐药基因多位点变异

赵 帅 孙静娜 代丽丽 李彦明 单保恩1耿玉兰 魏从真

(河北医科大学第一医院检验科，河北 石家庄 050031)

目的 分析拉米夫定(LAM)和恩替卡韦(ECV)联合用药及单独用LAM后老年乙肝患者乙肝病毒(HBV)耐药基因突变位点及与基因型的关系。方法 选择治疗前未检测出HBV-YMDD变异的老年乙肝患者100例，随机分为两组，在患者治疗后24个月检测基因分型和反转录酶(RT)区位点变异。结果 联合用药组中检出耐药突变类型分别为rtT184L+L180M+M204V、rtT184L+S202G+L180M+M204V、rtM250L+M204I；单用药组检出耐药基因突变类型分别为rtL180M+M204V、rtL180M+M204I、rtM204I。结论 初期使用LAM联合ECV治疗老年乙肝患者24个月后耐药突变率仅为6%；联合用药在B和C两种基因型中的耐药检出率没有明显不同。

联合用药；恩替卡韦；拉米夫定；慢性乙肝；基因型；RT区位点变异

慢性乙肝患者长期使用核苷类药物治疗后乙肝病毒(HBV)耐药基因位点变异是常见并不可避免的现象，老年乙肝患者发病率高，且并发症出现也较多，合并急性肝衰竭可达25%，肝炎病死率超过10%〔1〕。本研究观察恩替夫韦(ECV)联合拉米夫定(LAM)治疗老年乙肝患者24个月后血清基因型及HBV反转录酶(RT)区耐药率和突变类型，了解联合用药在慢性乙肝治疗和转归中预防或降低耐药率的有效性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 河北医科大学第一医院2012年1～12月门诊及住院老年慢性乙肝患者100例，治疗前未检测出HBV-YMDD变异，男67例，女33例，年龄62～70岁。分为联合用药组(50例)每日口服LAM 50 mg和ECV 0.5 mg，单独用药组(50例)每日单用 LAM 100 mg。两组一般资料无显著差异。

1.2 样本采集与贮存 治疗24个月后，采集静脉血于促凝真空采血管中，每管3 ml，离心后取上清，检测基因型，分析 RT 区(rt180M、rt184L、rt204V、rt204I、rtS202、rtM250)位点变异。

1.3 检测方法 HBV基因型分析、RT区耐药突变基因检测采用PCR-反向点杂交芯片法，仪器为检测仪器为BYQ6056E-298扩增仪和YN-H16杂交仪。试剂购自深圳亚能生物有限公司。所有操作步骤严格按说明书进行，同期室内质控合格。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行χ2检验。

2 结 果

联合用药组检出HBV耐药基因突变共3例，其变异类型分别为rtT184L+L180M+M204V(C基因型)、rtT184L+S202G+L180M+M204V(C基因型)、rtM250L+M204I(B基因型)各1例。C基因型33例中检出2例耐药突变，B基因型17例中检出1例耐药突变，两种基因型之间无统计学差异(校正χ2=0.36，P>0.05)，单独用药组检出HBV耐药基因突变共23例，其变异类型分别为rtL180M+M204V(6例，其中C基因型4例、B基因型2例)、rtL180M+M204I(5例，其中C基因型3例、B基因型2例)、rtM204I(12例，其中C基因型9例、B基因型3例)。C基因型35例中检出16例耐药突变，B基因型15例中检出7例患者耐药突变，两种基因型无统计学差异(χ2=0.00，P>0.05)。

3 讨 论

慢性乙肝体内HBV DNA的不断复制可导致肝硬化甚至肝癌，抗病毒药物核苷类似物可以干扰病毒DNA的合成，终止HBV的复制，但是长期服用核苷类似物药物可导致HBV产生耐药性。LAM是一种在结构上与核苷酸类似，可替代核苷酸参与DNA和RNA的合成过程，从而达到终止病毒复制的目的。研究〔2〕结果显示，LAM可迅速有效抑制HBV复制，长期应用可以显著改善肝细胞坏死并缓解肝脏纤维化进程，随着LAM的长期使用会产生耐药性，引起HBV P基因区180位点或204位点发生突变，影响了长期的治疗效果，5年耐药率高达60%～70%〔3〕。ECV是国内新上市的鸟嘌呤核苷类抗病毒药物，初治患者具有耐药率低，抗HBV强的特点，且在有效抑制 HBV-DNA复制、降低患者体内病毒载量的同时间接改善机体T细胞亚群免疫功能。Colonno等〔4〕发现，ECV在对LVD耐药的患者的抢救性治疗后96 w，耐药率为9%,LAM耐药的常见突变位点为rtM204I和rtL180M，经ECV用药后进一步增加出现rtT184、rtS202或rtM250等位点的突变，即出现多个位点的突变。有研究〔5～7〕结果显示，LAM耐药后会导致对ECV的敏感性下降近60倍，使治疗出现耐药基因突变后的挽救措施越来越困难，因此预防耐药基因突变的出现及优化治疗方案比耐药后的挽救显得越来越重要。目前联合治疗乙型肝炎已逐渐被国内外学者关注和认可，国外研究显示〔8〕，LAM联合ECV用药可使肝脏炎症在早期得到控制、对于肝纤维化的出现起到预防干预及延缓逆转的作用，疗效更佳。

杨瑞锋等〔9〕研究显示，DNA微阵列芯片法检测HBV耐药突变有很好的准确性，检测结果与克隆测序完全符合率达95.5%(214/224)。近些年来，基因芯片技术标准化，具有检测微量基因突变的高敏感性，由于具备快速和易于自动化等优势，可同时进行多种基因联合检测的特点，逐渐成为遗传疾病筛查及微生物耐药检测领域的前沿技术并开始在临床广泛使用〔10～12〕。薛瑞霞等〔13〕研究显示B、C基因型在我国慢性乙肝患者中为主要出现的基因型，且ECV多为LAM耐药后加用或换用，使rtM204V+rtL180M+rtT184L成为目前我国ECV耐药的主要变异类型，此结果与本研究结果相似。

1 成炳祥,陈红花,庄 莉.老年乙肝患者肝硬化相关危险因素的评估〔J〕.中华全科医学,2014;12(6):920-1.

2 徐东平.乙型肝炎病毒耐药的检测与判断〔J〕.中华肝脏病杂志,2009;17:61-3.

3 朱锦宏.阿德福韦酯联合拉米夫定治疗慢性乙肝的疗效研究〔J〕.药物与临床,2012;50(12):73-5.

4 Colonno RJ,Rose R,Levine S,etal.Entecavir two year resistance update:no resistance observed in nucleoside naive patients and low frequency resistance emergence in lamivudine refractory patients〔J〕.Hepatology,2005;42(Suppl 1):962.

5 Langley DR,Walsh AW,Baldick CJ,etal.Inhibition of hepatitis B virus polymerase by Entecavir〔J〕.J Vir,2007;81(8):3992-4001.

6 Park JW,Kim HS,Seo DD,etal.Long-term efficacy of entecavir in adefovir-refractory chronic hepatitis B patients with prior lamivudine resistance〔J〕.J Viral Hepat,2011;18(10):475-81.

7 Ling R,Harrison TJ.Functional analysis of mutations conferring lamivudine resistance on hepatitis B virus〔J〕.J Gen Virol,1999;80(Pt 3):601-6.

8 Schiff ER,Lee SS,Chao YC,etal.Long-term treatment with entecavir induces reversal of advanced fibrosis or cirrhosis in patients with chronic hepatitis B〔J〕.Clin Gastroen Hepatol,2011;9(3):274-6.

9 杨瑞锋,杜绍财,丛 旭,等.DNA微阵列芯片法检测慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变〔J〕.中华检验医学杂志,2010;33(11):1049-53.

10 张 华,刘宇清,王幼勤,等.遗传性耳聋基因芯片检测及其临床意义〔J〕.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009;23(11):1032-5.

11 Zhu LX,Zhang ZW,Liang D,etal.Multiplex asymmetirc PCR-based oligonucleotide microarray for detection of dru g resistance genes containing single mutations in Enterobacteriaceae〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2007;51:3707-13.

12 Guo Y,Zhou Y,Wang C,etal.Rapid，accurate determination of nmhidrug resistance in Mtuberculosis isolates and sputum using a biochip system〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis,2009;13:914-20.

13 薛瑞霞,张缭云,杨 松,等.恩替卡韦治疗失败的慢性乙型肝炎患者耐药分析20例〔J〕.世界华人消化杂志,2009;17(12):1260-3.

〔2016-02-23修回〕

(编辑 苑云杰)

河北省卫生厅科研立项(20130565)

魏从真(1984-)，女，主管检验师，硕士，主要从事微生物免疫检验研究。

赵 帅(1982-)，女，主管检验师，硕士，主要从事微生物免疫检验研究。

R512.6

A

1005-9202(2017)10-2484-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.061

1 河北医科大学第四医院检验科