国内新型基因2型牛病毒性腹泻病毒研究进展

张 倩，陶 洁,3，张 东，区炳明，林 航，杨 颖，张信军，朱礼倩，王建业，贺生中，孟 婷，谢 静，朱国强

（1.扬州大学兽医学院，扬州225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009；3.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；4.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300）

·综述·

国内新型基因2型牛病毒性腹泻病毒研究进展

张 倩1,2，陶 洁1,2,3，张 东1,2，区炳明1,2，林 航1,2，杨 颖1,2，张信军1,2，朱礼倩1,2，王建业1,2，贺生中4，孟 婷4，谢 静4，朱国强1,2

（1.扬州大学兽医学院，扬州225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009；3.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；4.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）有两种基因型：基因1型（BVDV-1）和基因2型（BVDV-2）。以往的流行病学调查显示BVDV-1的分布和流行区域更加广泛，但近年来国内BVDV-2的发病率呈持续升高趋势。BVDV-2通常会引起严重的急性感染和出血综合征，给养牛业造成巨大损失。本文就BVDV-2特异性检测方法和基因分型的建立，型特异性BVDV-2毒株的分离与鉴定，BVDV-2优势分离株的全基因组测定与遗传特性分析及BVDV-1和BVDV-2抗原和抗体检测平台的建立等方面展开简要综述。

牛病毒性腹泻病毒；分离株；检测；鉴定；全基因组

牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea，BVD）是牛的主要病毒性传染病，呈世界性流行，其病原为黄病毒科瘟病毒属成员——牛病毒性腹泻病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV），属正股RNA病毒[1]。根据基因组的遗传特性，BVDV分为基因1型(BVDV-1)和基因2型（BVDV-2）两种基因型，Giangaspero等[2]根据5'-UTR序列二级结构的差异将BVDV-2分为BVDV-2 a、2 b、2 c及2 d 4个亚型，但2010年Ridpath等[3]建议将BVDV-2分为2个亚型（2a和2b）[3]。BVDV-1目前已可分为16个亚型，即1a～1p[4]。此外，根据BVDV能否诱导细胞病变，又可分为致细胞病变（cytopathogenic，CP）与非致细胞病变（noncytopathogenci，NCP）两种生物型[5]。由于不同基因型、生物型间呈现较大异质性[6]，所以国际病毒分类委员会已在第9次报告中将两者分为2个种[7,8]。

自1989年在美国首次报道BVDV-2感染以来，在北美大陆[9]、日本[10]、比利时[11,12]、法国[13]、波兰[14]、巴西南部[15]、德国[16]等地相继报道分离到BVDV-2野毒株。与经典型BVDV-1感染症状相同，大多数牛感染BVDV-2后表现温和的亚临床症状，主要为腹泻、呼吸道症候群，但BVDV-2可呈持续感染状态[5,6]。自20世纪90年代来，从上述流行地区牛急性爆发病例中分离和鉴定的病原几乎都是BVDV-2，给养牛业造成巨大的经济损失。因此世界各国将BVDV-2的防疫与监控作为BVDV流行病学调查的重点[9,10,16-20]。自1983年以来，我国吉林省、天津市、内蒙古自治区、青海省、陕西省、江苏省、河南省、河北省、重庆市、新疆维吾尔自治区、广西壮族自治区、黑龙江省等地牛群中相继被检测出BVDV抗原和抗体[21-33]。近年来，多个地区也报道猪、羊、鹿和野生动物感染BVDV[34-38]，但我国仍未从分子水平上对BVDV 分离株的基因型进行明确定义，并且国内BVDV-2流行现状以及其分离株特性不明确，进而难以为我国BVDV-2的预报、预警和有效防控提供资料。本文将从以下4个方面:BVDV-2特异性检测方法和基因分型的建立，型特异性BVDV-2毒株分离与鉴定，BVDV-2 优势分离株的全基因组测定与遗传特性分析以及BVDV-1和BVDV-2 抗原和抗体检测平台的建立开展了系统研究，并结合本实验室的成果对国内BVDV-2研究现状进行分析。

1 BVDV-2 RT-PCR 检测和分型方法的建立[39]

RT-PCR是目前应用较广泛的分子生物学技术，理论上可以检测出几个病毒粒子的存在，并在24 h内得出结果，具有耗时短、敏感性高、特异性好等优点。在大多数情况下，RT-PCR 的检测病毒敏感性比病毒分离培养检测水平的敏感性高10～1000倍[40]，为病毒检测提供了一条简单有效的途径。

通常在病原的保守区域设计RT-PCR 检测引物，而5'非编码区（5'-untranslated region，5'-UTR）序列是在瘟病毒属中保守程度最高的区域，因此根据这一区域设计RT-PCR 的检测引物或分型引物为最佳[41]。我们通过分析比较已发表的BVDV-1、BVDV-2 的5'-UTR 序列，分别设计出仅针对BVDV-1型或BVDV-2型的特异性引物和同时针对BVDV-1和BVDV-2两型的通用引物，以实验室标准参考株BVDV-1 NADL株和BVDV-2890株为模板，建立了RT-PCR检测方法。在此基础上，进一步对疑似牛BVDV-2 感染的临床病料组织（脾脏、淋巴结、心肌、血液等）进行检测。结果表明，在所检测的98 份样品中，BVDV-2 阳性20 份（阳性率约20%）。将上述20 份经RT-PCR 鉴定为阳性的组织病料感染MDBK 细胞，进行病毒分离和传代，结合感染细胞病变观察和RT-PCR 验证组织病料感染的细胞，阳性组织病料病毒分离率为100%。熊浩等[42]根据GenBank 已发表的BVDV-1和BVDV-2型 5'-UTR保守序列，设计2对针对基因1 型和2 型的特异性引物，经反应条件的优化，建立了在同一反应体系中同时检测BVDV-1和BVDV-2的RT-PCR方法。结果显示该方法对2个基因型的病毒检测灵敏度均为2TCID50，只比单重PCR 的灵敏度低了10倍，且具有较好的特异性和可重复性。经临床应用验证，建立的RT-PCR可用来对2个基因型的BVDV 进行同步分型检测。张剑云等[43]利用已建立的BVDV-2 RT- PCR检测方法对新疆某地鹿场的疑似病例进行检测，检出阳性结果7例，证明该鹿场存在BVDV-2感染。

2 BVDV-2分离株的分离与鉴定[44-46]

在已建立的RT-PCR 检测方法的基础上，本实验室将来自江苏省、山东省、河南省、新疆维吾尔自治区、青海省、陕西省6省市疑似为BVDV-2感染的200份临床病料样品，进行BVDV-2型特异性RTPCR检测，40 份结果为阳性（阳性率20%）。

将上述40份阳性样品接种MDBK 或BT 单层细胞，进行病毒分离培养和传代。间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay，IFA）亦表明，分离的40 株细胞源BVDV-2 病毒能被鼠源BVDV-2重组E2蛋白抗血清或鼠源BVDV-2单克隆抗体特异性识别。基于本实验室建立的双抗夹心ELISA检测上述40株细胞源BVDV-2病毒，结果同样均为阳性。进一步观察分离株的致细胞病变情况，发现其中NCP 型有38 株，经MDBK 细胞盲传10代以上，在显微镜下仍不产生任何细胞病变；CP 型有2 株，命名为XJ-04和SD-06 分离株，并分别盲传至13 代和8 代，光学显微镜下观察到病毒感染的MDBK 细胞内空泡化、细胞脱落、呈现拉网状的典型细胞病变。将上述代表性细胞源BVDV-2 病毒感染的MDBK细胞制备超薄切片，在透射电镜下观察，从形态发生学上予以鉴定，发现细胞内质网中有约60 nm 大小的病毒粒子，从而证实了病毒在感染细胞的内质网内成熟的说法[47]。此外，经差速离心、20%蔗糖垫底超速离心提纯的病毒粒子，经磷钨酸染色，在负染电镜下观察到有囊膜、粒子大小约60 nm 的病毒颗粒。鉴定结果与BVDV 的形态发生学上的前期研究报道相符[48-50]。

朱梅胜等[51]对山东省某肉牛养殖场犊牛粪便进行细菌、病毒的分离和鉴定，初步判定该场犊牛出血性腹泻病例是由O8型大肠埃希菌和BVDV-2混合感染造成的。王国超等[52]为了了解新疆奶牛中是否存在BVDV-2 的感染，从新疆沙湾县周边牛场采集临床症状疑似BVDV 感染牛的病料，经RT-PCR 检测，并将阳性病料处理后接种MDBK 单层细胞，同时设立正常细胞和接种NADL 毒102 株细胞作对照，进行病毒分离鉴定。结果从阳性血液样品中分离出1 株CPE 型的BVDV 毒株（命名为BVDVSW）。电镜观察到球形、有囊膜、直径约为50～60 nm、囊膜表面有突起的病毒粒子。对该分离株5'UTR 和E2 基因的序列分析比较，证实所分离的毒株为BVDV-2。遗传进化分析表明，该分离株与17237 毒株（BVDV-2型，分离于欧洲）具有较近的亲缘关系，证实新疆奶牛中存在BVDV-2 的感染，并且具有较强的致病力。聂兆晶等[53]为了解BVDV在猪用活疫苗生产过程中的污染情况，将检测结果为阳性的1 份犊牛血清，接种于MDBK 细胞上，盲传3 代后出现明显细胞病变，经RT-PCR 检测，结果为BVDV-2。

3 BVDV-2分离株的全基因组测定与遗传特性分析[45, 46, 54, 55]

病原分离株全基因组的测定是重要的分子流行病学资料，而遗传特性的分析又是是追溯病毒的传播来源和预测病毒病流行趋势的重要基础。本实验室利用RT- PCR 方法分别扩增来自国内6 省市16 株BVDV-2 分离株的5'-UTR、Npro、糖蛋白E2 编码基因和非结构蛋白NS2-3 基因，扩增出的序列片段与预期值大小相一致，并进一步将目的基因片段克隆、序列测定。序列测定结果和核苷酸、氨基酸序列同源性比较分析表明，上述国内16株BVDV-2分离株同源性高达99%以上，很有可能是由同一毒株进化而来。

为进一步了解BVDV-2 的遗传特性，我们采用RT-PCR 方法分段扩增XJ-04 代表株全基因组序列，并克隆、测序，将各序列进行拼接后成功获得了XJ-04 株全基因组序列，全长为12 284 bp（GenBank 登录号:FJ527854）。通过5'-UTR、全基因组序列进化树的构建及分析，并结合自我裂解酶（Npro）和结构蛋白（C、Erns、E1、E2）与标准株BVDV-1 NADL和BVDV-2 890 进行核苷酸、氨基酸序列同源性比较分析，我们发现XJ-04 与BVDV-2 中890、NewYork93 株亲缘关系最近，归入BVDV-2a 亚型。有研究表明，NS2/3 基因中碱基的插入、缺失、重排、替换等可导致NCP 型BVDV 向CP 型BVDV 的转变[56-58]，但PCR 检测发现在致细胞病变型的XJ-04株NS2/3 基因上没有任何外源基因的插入。这为我们今后探索BVDV-2 的生物型转化机制等提供了科学依据。此外，陶洁等[59]对实验室分离保存的1 株猪源BVDV（SH-28）进行了全基因组测序，全基因组进化树结果表明，虽然SH-28 与HLJ-10同处于一个分支上，但其与XJ-04 的全基因组核苷酸同源性最高（92.3%），而与另外2 株猪源BVDV-1(ZM-95、SD0806)的亲缘性较远（70.0%、70.1%）。5'-UTR进化树结果显示SH-28分离株属于BVDV-2a2基因亚型，而HLJ-10 和XJ-04 株属于BVDV-2a1。李庆超等[60]利用MDBK 增殖1株分离于我国吉林省的牛源牛病毒性腹泻病毒JZ05-1 毒株，然后使用RT-PCR 方法分别扩增覆盖基因组全长的8个片段并测序，拼接获得该病毒的全基因组序列长12285核苷酸（GenBank登录号:GQ888686）。分析BVDVJZ05-1 的5'-UTR序列和全基因组序列，发现该病毒属于BVDV-2a亚型[60]。

BVDV-2 国内分离株全基因组序列的测定和遗传特性的分析，不仅丰富了我国BVDV的分子流行病学资料，而且为BVDV-2 遗传演化规律的探究提供了线索，有助于后续BVDV-2 的防控。

4 BVDV-1和BVDV-2抗原抗体检测平台的建立[61,62]

为解决临床上出现的检测样本难、检测灵敏度低、耗时等难题，本实验室一直致力于优化BVDV检测方法的研究。我们已构建出高效诱导表达1型和2型BVDV糖蛋白E2的PET原核表达系统，制备出的E2 重组蛋白作为抗原，建立间接ELISA 方法。用建立的ELISA对江苏省部分地区牛群抗体进行监测，结果表明，该地区BVDV 阳性感染率普遍较高。

我们进一步研制出抗1型和2型BVDV糖蛋白E2的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株2株（3F9 和3D8），腹水ELISA 滴度分别达到216和10×27。利用单克隆抗体的高度特异性并结合BAS（biotinavidin system，生物素-亲合素系统）的灵敏性，设计了一种灵敏度高、特异性强的检测BVDV 的双抗体夹心ELISA 方法，基于3D8（IgM 类）为捕获抗体，biotin 标记的3F9（IgG 类）作为第二抗体。运用方阵滴定实验确定捕获抗体最佳工作浓度为2 μg/mL，Biotin-3F9 工作效价为60 ng/mL， E2 蛋白最低检出量为84 ng/mL。利用建立的双抗体夹心ELISA 方法检测35 份病牛血清样本，13份为阳性与RT-PCR 的符合率达到94.29%。结果表明我们所建立的BAS-ELISA 方法可用于BVDV 感染的临床特异性诊断，为建立单抗介导的检测BVDV-1 和BVDV-2 抗原、抗体的血清学方法和实现实验室诊断的标准化奠定了良好的基础。

范晴等[63]用兔抗BVDV多抗作为包被抗体，BVDV NS3 单克隆抗体作为捕获抗体，建立了检测BVDV 抗原的捕获ELISA 方法，对各项反应条件进行优化，获得的最佳工作条件为:兔多抗1∶1 600稀释包被，NS3 单抗1∶2000稀释，酶标抗体工作浓度1∶4000稀释。特异性和敏感性检测结果表明，该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌无交叉反应，最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量，与RT-PCR 方法的符合率为100%。建立的BVDV 抗原捕获ELISA 方法快速、特异、敏感，可用于BVDV 抗原的检测。李文文等[64]使用BVDV全病毒蛋白作为包被原，建立了检测BVDV 的间接ELISA 检测方法，并且探讨了CP 型BVDV 与NCP型BVDV 抗原免疫原性差异。结果显示，CP 型BVDV 的高免血清效价均比NCP 型BVDV 高免血清的效价平均高35%，且差异明显。

国内针对这些BVDV-1 和BVDV-2 抗原、抗体建立的检测平台，有助于我国BVDV-2的预报、预警，而且为BVDV 的诊断和疫苗研发提供了理论指导。

5 总结

随着中国加入WTO，畜产品走向国际市场，首先要解决的就是动物疫病的有效控制。在加入WTO 后的农业经济结构调整，对全国养牛业和乳牛业高效、优质、可持续性发展起到重要的保障作用和积极的推动作用。目前我国处于加大动物保护的免疫密度，抵御外界动物疫情入侵的关键时期。因此，政府主管部门按照国家防治牛群重要疫病的规划，要求迅速提高免疫密度，这就对（奶）牛重要疫病防制的疫苗的质量和数量提出了更高的要求。所以我们需要从基础做起，首先着手于病原的流行病学，积累大量数据，进而深入探究流行毒株的特性、感染机制及疫苗研制方法，并不断完善试验成果，为动物疫病的防制贡献力量。

[1] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 5版. 北京∶ 中国农业出版社, 2013∶ 475-476.

[2] Giangaspero M, Harasawa R,Weber L, et al. Genoepidemiological evaluation of Bovine viral diarrhea virus 2 species based on secondary structures in the 5'untranslated region[J]. J Vet Med Sci, 2008, 70(6)∶ 571-580.

[3] Ridpath J F, Fulton R W, Kirkland P D, et al. Prevalence and antigenic differences observed between Bovine viral diarrhea virus subgenotypes isolated from cattle in Australia and feedlots in the southwestern United States[J]. J Vet Diagn Invest, 2010, 22(2)∶ 184-191.

[4] Xue F, Zhu Y M, Li J, et al. Genotyping of bovine viral diarrhea viruses from cattle in China between 2005 and 183 2008[J]. Vet Microbiol, 2010, 143(2)∶ 379-383.

[5] Ridpath J, Bolin S, Dubovi E. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes[J]. Virology, 1994, 205(1)∶66-74.

[6] Ridpath J F, Bolin S R. Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viral diarrhoea virus (BVDV) by PCR[J]. Mol Cell Probes, 1998, 12(2)∶ 101-106.

[7] Serio D, Virus taxonomy∶ ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[C]. 2012∶ 1221-1234.

[8] Weber M N, Streck A F, Silveira S, et al. Homologous recombination in pestiviruses∶ Identification of three putative novel events between different subtypes/ genogroups[J]. Infect Genet Evol, 2015, 30∶ 219-224.

[9] Ridpath J, Neill J, Frey M, et al. Phylogenetic, antigenic and clinical characterization of type 2 BVDV from North America[J]. Vet Microbiol, 2000, 77(1)∶ 145-155.

[10] Nagai M, Ito T, Sugita S, et al. Genomic and serological diversity of bovine viral diarrhea virus in Japan[J]. Arch Virol, 2001, 146(4)∶ 685-696.

[11] Letellier C, De Meulemeester L, Lomba M, et al. Detection of BVDV persistently infected animals in Belgium∶ evaluation of the strategy implemented[J]. Prev Vet Med, 2005, 72(1)∶ 121-125.

[12] Pratelli A, Martella V, Cirone F, et al. Genomic characterization of pestiviruses isolated from lambs and kids in southern Italy[J]. J Virol Methods, 2001, 94(1)∶81-85.

[13] Kim I J, Hyun B H, Shin J H, et al. Identification of bovine viral diarrhea virus type 2 in Korean native goat (Capra hircus)[J]. Virus Res, 2006, 121(1)∶ 103-106.

[14] Polak M P, Kuta A, Rybałtowski W, et al. First report of bovine viral diarrhoea virus-2 infection in cattle in Poland[J]. Vet J, 2014, 202(3)∶ 643-645.

[15] Weber M, Silveira S, Machado G, et al. High frequency of bovine viral diarrhea virus type 2 in Southern Brazil[J]. Virus Res, 2014, 191∶ 117-124.

[16] Wolfmeyer A,Wolf G, Beer M, et al. Genomic (5'UTR) and serological differences among German BVDV field isolates[J]. Arch Virol, 1997, 142(10)∶ 2049-2057.

[17] Flores E, Gil L, Botton S, et al. Clinical, pathological and antigenic aspects of bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 2 isolates identified in Brazil[J]. Vet Microbiol, 2000, 77(1)∶ 175-183.

[18] Jones L R, Zandomeni R, Weber E L. Genetic typing of bovine viral diarrhea virus isolates from Argentina[J]. Vet Microbiol, 2001, 81(4)∶ 367-375.

[19] Vilček Š, Paton D, Durkovic B, et al. Bovine viral diarrhoea virus genotype 1 can be separated into at least eleven genetic groups[J]. Arch Virol, 2001, 146(1)∶ 99-115.

[20] Beer M, Wolf G, kaaden O R. Phylogenetic Analysis of the 5′-Untranslated Region German BVDV Type II Isolates[J]. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2002, 49(1)∶ 43-47.

[21] 高双娣, 贾文孝. 西北和西南五省 (区) 部分地区黄牛牦牛牛病毒性腹泻/粘膜病血清学监测[J]. 中国兽医科技, 1999, 29(7)∶ 17-18.

[22] 谭春萍, 张艳雯, 黄福标, 等. 广西部分地区牛病毒性腹泻病毒和副结核分枝杆菌流行情况调查[J]. 黑龙江畜牧兽医∶ 下半月, 2015(1)∶ 69-70.

[23] 韩冬艳, 邱杨, 单松华, 等. 新疆某地牛群中检出BVDV[J]. 中国动物检疫, 2001(2)∶ 001.

[24] 申之义, 赵心力. 内蒙古地区牛病毒性腹泻—粘膜病流行病学调查[J]. 中国兽医杂志, 1995, 21(8)∶ 5-6.

[25] 马秋明, 王学艳, 王晶钰, 等. 牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与 NS5b 基因序列测定[J]. 西北农林科技大学学报∶ 自然科学版, 2008, 36(12)∶ 1-6.

[26] 张光辉, 王富晓. 河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定[J]. 河南畜牧兽医, 2005, 26(5)∶ 8-10.

[27] 邱昌庆, 郭慧琛. 安徽, 江苏, 广西部分地区水牛牛病毒性腹泻/粘膜病血清学监测[J]. 中国预防兽医学报, 2000, 22(6)∶ 453-454.

[28] 赵月兰, 杨汉春, 左玉柱, 等. 河北省奶牛牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定[J]. 中国动物检疫, 2006, 23(11)∶29-32.

[29] 杨得胜, 黄雁, 洪英, 等. 2006 年福建省牛病毒性腹泻病的血清学调查[J]. 动物医学进展, 2007, 28(9)∶ 49-51.

[30] 宋永峰, 张志, 张燕霞, 等. 猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探[J]. 中国动物检疫, 2008, 25(7)∶ 25-27.

[31] 杨泽林, 冉智光, 曾政,等. 重庆市部分地区牛病毒性腹泻/粘膜病血清流行病学调查[J]. 畜牧市场, 2009(10)∶ 28-29.

[32] 唐新仁, 陈亮, 傅小平. 牛病毒性腹泻病 (BVD) 对牧场生产的直接影响[J]. 中国奶牛, 2009(11)∶ 55-57.

[33] 张国华, 吴丹丹, 周玉龙,等. 牛病毒性腹泻病毒黑龙江分离株的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2015, 37(10)∶805-807.

[34] Mishra N, Rajukumar K, Vilcek S, et al. Molecular characterization of bovine viral diarrhea virus type 2 isolate originating from a native Indian sheep (Ovies aries)[J]. Vet Microbiol, 2008, 130(1)∶ 88-98.

[35] Liebler-Tenorio E, Ridpath J, Neill J. Lesions and tissue distribution of viral antigen in severe acute versus subclinical acute infection with BVDV2[J]. Biologicals, 2003, 31(2)∶ 119-122.

[36] Carman S, van Dreumel T, Ridpath J, et al. Severe acute bovine viral diarrhea in Ontario, 1993-1995[J]. J Vet Diagn Invest, 1998, 10(1)∶ 27-35.

[37] Pellerin C, Van Den Hurk J, Lecomte J, et al. Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities[J]. Virology, 1994, 203(2)∶ 260-268.

[38] Vilček Š, Ďurkovič B, Bobakova M, et al. Identification of bovine viral diarrhoea virus 2 in cattle in Slovakia[J]. Vet Rec, 2002, 151(5)∶ 150-152.

[39] 任敏, 焦海宏, 蒋颖, 等. 基因 2 型牛病毒性腹泻病毒RT—PCR 检测方法的建立和初步应用[J]. 中国预防兽医学报, 2008, 30(9)∶ 665-668.

[40] Jiménez-Clavero M A, Escribano-Romero E, Mansilla C, et al. Survey of bovine enterovirus in biological and environmental samples by a highly sensitive real-time reverse transcription-PCR[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(7)∶ 3536-3543.

[41] Brock K V, Deng R, Riblet S M. Nucleotide sequencing of 5' and 3' termini of bovine viral diarrhea virus by RNA ligation and PCR[J]. J Virol Methods, 1992, 38(1)∶ 39-46.

[42] 熊浩, 季新成, 王克栋, 等. 牛病毒性腹泻病毒基因分型双重 RT-PCR 方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2013(4)∶39-42.

[43] 张剑云, 任敏, 焦海宏. 鹿源基因 2 型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR 检测研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2011(2)∶ 52-53. [44] 任敏, 朱礼倩, 焦海宏,等. 基因 2 型牛病毒性腹泻病毒新疆及山东分离株的鉴定[J]. 中国动物传染病学报, 2009, 17(4)∶ 20-25.

[45] Zhu L, Ren M, Lin Y, et al. Identification of a bovine viral diarrhea Virus 2 isolated from cattle in China[J]. Acta Virol, 2008, 53(2)∶ 131-134.

[46] Zhu L, Lin Y, Ding X, et al. Genomic sequencing and characterization of a Chinese isolate of Bovine viral diarrhea virus 2[J]. Acta Virol, 2008, 53(3)∶ 197-202.

[47] Rümenapf T, Unger G, Strauss J H, et al. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses[J]. J Virol, 1993, 67(6)∶ 3288-3294.

[48] 张荣兴, 王新华. 牛病毒性腹泻病毒的成熟和释放[J]. 中国病毒学, 1995, 10(1)∶ 86-91.

[49] Greiser-Wilke I, Dittmar K, Liess B, et al. Immunofluorescence studies of biotype-specific expression of bovine viral diarrhoea virus epitopes in infected cells[J]. J Gen Virol, 1991, 72(pt8)∶ 2015-2019.

[50] 王新华, 刘守仁, 张荣兴, 等. 牛病毒性腹泻病毒侵染宿主细胞的电镜观察[J]. 畜牧兽医学报, 2002, 33(5)∶ 501-503.

[51] 朱梅胜, 张新兵, 张毅, 等. 致犊牛出血性腹泻病原的分离与鉴定[J]. 动物医学进展, 2015, 36(5)∶ 132-136.

[52] 王国超, 王沪生, 乔军, 等. 新疆 BVDV 基因 2 型毒株的分离与鉴定[J]. 中国畜牧兽医学会 2013 年学术年会论文集, 2013.

[53] 聂兆晶, 田夫林, 姜世金. 一株 2 型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在 MDBK 细胞上的克隆纯化[J]. 西北农业学报, 2012, 21(1)∶ 21-25.

[54] 林燕清, 朱礼倩, 陶洁,等. 牛病毒性腹泻病毒基因 2 型代表株全基因组序列分析[J]. 中国预防兽医学报, 2011,33(1)∶ 23-27.

[55] Tao J, Lin Y, Zhu G. Identification and characterization of 16 recent Chinese isolates of bovine viral diarrhea virus genotype 2 (BVDV-2)[J]. Afr J Microbiol Res, 2011, 5(11)∶ 1272-1276.

[56] Kümmerer B M, Stoll DMeyers G. Bovine viral diarrhea virus strain Oregon∶ a novel mechanism for processing of NS2-3 based on point mutations[J]. J Virol, 1998, 72(5)∶4127-4138.

[57] Tautz N, Meyers G, Stark R, et al. Cytopathogenicity of a pestivirus correlates with a 27-nucleotide insertion[J]. J Virol, 1996, 70(11)∶ 7851-7858.

[58] Tautz N, Thiel H-J, Dubovi E J, et al. Pathogenesis of mucosal disease∶ a cytopathogenic pestivirus generated by an internal deletion[J]. J Virol, 1994, 68(5)∶ 3289-3297.

[59] 陶洁, 王银, 廖金虎, 等. 猪源牛病毒性腹泻病毒 SH-28分离株的全基因组序列及遗传进化分析[J]. 中国兽医学报, 2013, 33(3)∶ 321-325.

[60] 李庆超, 苗利光, 李海涛, 等. 中国牛病毒性腹泻病毒JZ05-1 分离株全基因测序及分析[J]. 病毒学报, 2010, 26(3)∶ 238-243.

[61] 孙宏进, 蒋颖, 林燕清,等. 抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研制[J]. 扬州大学学报∶ 农业与生命科学版, 2009, 30(4)∶ 1-5.

[62] 林燕清. BVDV-2 分离株 XJ-04[D] 全基因组测序和抗BVDV 单克隆抗体制备及初步应用[D]. 扬州∶ 扬州大学, 2010.

[63] 范晴, 谢芝勋, 谢志勤, 等. 牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA 方法的建立[J]. 动物医学进展, 2015, 36(2)∶ 21-24.

[64] 李文文, 刘情, 刘亚刚. 牛病毒性腹泻病毒间接 ELISA 方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2015, 42(3)∶ 558-562.

RESEARCH PROGRESS OF GENOTYPE 2 BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUSIN CHINA

ZHANG Qian1,2, TAO Jie1,2,3, ZHANG Dong1,2, OU Bing-ming1,2, LIN Hang1,2, YANG Ying1,2, ZHANG Xinjun1,2, ZHU Li-qian1,2, WANG Jian-ye1,2, HE Sheng-zhong4, MENG Ting4, XIE Jing4, ZHU Guo-qiang1,2

(1.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2.Prevention and Control of Collaborative Innovation Center of the Important Animal Disease and Zoonosis in Jiangsu Province, Yangzhou 225009, China; 3.Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 4 Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China)

Bovine viral diarrhea virus is divided into two genotypes∶ genotype 1 (BVDV-1) and genotype 2 (BVDV-2). Previous epidemiological survey showed BVDV-1 isolates distributed more widely. However, the mobidity rate of BVDV-2 is increasing in recent years. In general, BVDV-2 infection can cause more severe disease characterized by acute infection and haemorrhagic syndrome, causing enormous losses to the cattle industry. In this review, we dilate on the following aspects∶ the establishment of the specifi c detection and genotyping methods of BVDV-2, the isolation and identifi cation of BVDV-2, complete genomic sequencing and phylogenetic analyzation of BVDV-2 isolates, and the establishment of detection platform to virus and antibody of BVDV-1 and BVDV-2.

Bovine viral diarrhea virus; isolates; detection; identifi cation; complete genome

S852.659.6

A

1674-6422（2017）01-0080-07

2016-02-04

科技部畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发重点专项（2016YFD0500900）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；重大动物疫病防控技术引进（国家农业部948计划，2011-G24）；江苏省属高校自然科学重大基础研究项目（14KJA230001）；江苏省农业支撑项目（BE2014358）；泰州市农业科技计划项目（TZ201421）

张倩，女，硕士研究生，预防兽医学专业；陶洁，女，助理研究员，主要从事动物病毒学研究

朱国强，E-mail∶ yzgqzhu@yzu.edu.cn