猪瘟分子生物学检测技术的研究进展

石远菊，汤德元，曾智勇，王 彬，黄 涛，韦冠东，胡玲玲，龙冬梅，杨 伟，叶 丽

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪瘟分子生物学检测技术的研究进展

石远菊，汤德元*，曾智勇，王 彬，黄 涛，韦冠东，胡玲玲，龙冬梅，杨 伟，叶 丽

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，给养猪业造成了严重的经济损失，严重制约着我国养猪产业的发展。文章主要针对猪瘟病毒的反转录-聚合酶链式反应技术、反转录巢式PCR技术、多重反转录-聚合酶链式反应技术、反转录实时荧光定量PCR技术及环介导等温核酸扩增技术等5种分子生物学检测技术的国内外最新研究进展进行综述，以期提高对猪瘟病毒早期感染和隐性带毒猪的检出率，淘汰野毒感染猪群，为猪瘟的净化和防控提供重要诊断参考依据。

猪瘟；分子生物学；快速诊断；检测技术

猪瘟（Classical swine fever CSF）又名古典猪瘟、猪霍乱，我国又将其称为烂肠瘟，是由猪瘟病毒(Classical swine fever Virus，CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，以发病急、高热稽留和细小血管壁变性，引起全身皮肤、黏膜和浆膜泛发性小出血点，脾脏梗死为特征。猪瘟的发生没有季节性，各种年龄段和不同种类的猪群均可感染，典型猪瘟发病率和死亡率都高，给养猪业造成了巨大的经济损失。全世界许多国家都对该病制定了根除计划，据报道，有的国家已经成功地净化了猪瘟。我国是发展中国家，物力和财力有限，对欧洲国家采取的检疫扑杀措施难以承受。近年来，随着猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用，我国猪瘟的流行情况和发病特点发生了很大的变化，主要表现为：病程明显延长，由急性和亚急性转变为慢性为主；病原毒力降低，易出现持续感染、胎盘垂直感染、妊娠母猪带毒综合征及新生仔猪的免疫耐受等，发病率和死亡率明显下降；流行情况从频发的大流行转变为无规律的地区性散发性流行，疫点显著减少；临床症状由典型转变为非典型温和性猪瘟和母猪带毒综合征。猪瘟的非典型性给猪瘟的诊断带来了新的困难，尽管常规的临床诊断和实验室诊断（猪体回归感染试验、兔体交叉免疫试验、病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、中和试验、免疫胶体金技术、金标卡诊断、新城疫病毒强化试验、免疫荧光试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、髓细胞检查法、免疫酶测定技术或酶标记抗体诊断法和单克隆抗体免疫过氧化物酶试验等）对猪瘟的诊断有一定的帮助，但分子生物学检测技术以其高特异性、高灵敏性在广大的科研实验中得到了广泛的应用。

CSFV的分子生物学检测技术主要包括：普通反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术、反转录巢式PCR(Nested RT-PCR)技术、多重反转录-聚合酶链式反应(mRTPCR)技术、反转录实时荧光定量PCR (RTFQ RT-PCR)技术及环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)技术等，现将这些分子生物学检测技术的国内外最新研究进展分述如下：

1 RT-PCR技术

RT-PCR技术是将扁桃体活体组织或病死猪的扁桃体、淋巴结、肺脏、脾脏、肾脏和大脑等组织研磨，提取RNA，然后进行RT-PCR扩增合成目的片段。该技术特异性较强、灵敏度较高、重复性好、易操作，整个实验过程只需要几个小时就能达到快速检测的目的。

国外TitovI[1]等建立了RT-PCR技术和高分辨率融合（HRM）分析相联合来鉴别CSFV疫苗株和野毒株的快速方法。该方法首先利用CSFV E2基因的最可变区的短片段进行RT-PCR扩增，随后再用HRM来分析扩增的目的片段。实时PCR/HRM用于CSFV检测和分化分析具有与RT-qPCR和基因分型相当的灵敏度分辨率且与E2核苷酸测序相当。该方法仅用一个步骤就能在现场样品中进行CSFV的快速、灵敏的鉴定以及基因型的鉴别，操作简单，对于基层猪瘟的快速诊断是非常有价值的。

秦玉明[2]在国内外首次建立了原位RT-PCR法，该方法能检测组织切片中的CSFV RNA分子，在检测病毒的同时还可以初步观察到组织的病理变化，将猪瘟病理学研究由组织病理学水平发展到分子病理学水平，为以后研究猪瘟的隐性感染和持续性感染的致病机理奠定了基础。郭抗抗[3]等建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法，该方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187 bp和492 bp的特异性片段，对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性，利用该方法可以从10份疑似猪瘟临床样品中分别检测出猪瘟强毒和疫苗毒，说明该研究建立的RT-PCR方法具有较好的特异性，为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。

陈本龙[4]等成功建立了一种能够区分猪瘟病毒强毒株HCLV株的RTPCR检测方法，该法从猪瘟强毒株和兔化弱毒株中扩增出了大小分别为680 bp和785 bp的特异性片段，具有高度的特异性和敏感性。吴旭锦[5]等建立了猪瘟病毒的RT-nPCR检测方法，该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5ng/L，从BVDV，PRRSV，PCV2，PRV和PPV等参考毒株中提取或反转录获得的DNA/cDNA中不能扩增出目的条带，说明该方法灵敏度高、特异性强。

汤德元[6]等通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对，发现猪瘟兔化弱毒疫苗株3'-NTR独立存在富含T的插入序列，根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一RTPCR引物并选择特异保守区域设计了二重RT-PCR引物，优化筛选能够鉴别猪瘟野毒与兔化弱毒疫苗的PCR反应条件，建立了能鉴别猪瘟野毒和疫苗毒的单一与二重RT-PCR的鉴别诊断方法，该方法从猪瘟野毒株和兔化弱毒株中扩增出了大小分别为372 bp和140 bp的特异性片段；利用该方法进行敏感性和特异性分析，单一RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2 pg(单一RT-PCR中的1对引物)和1.7 pg(单一RT-PCR中的另外1对引物)；二重RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2 pg（猪瘟野毒)和6.7 pg（猪瘟疫苗毒)，两种方法均未检测到PRV，PRRSV，JEV，BVDV，PCV2的DNA/RNA；此外，还采用该方法对146份可疑临床样品进行检测，猪瘟疫苗毒与野毒在繁殖母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%，7.4%，8.3%，8.6%。实验结果表明：单一与二重RT-PCR方法均具有敏感性强、特异性高、重复性好的特点，该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。

2 Nested PCR技术

Nested PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物（又称为巢式引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于：如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，Nested PCR的扩增特异性高。

罗勇[7]利用序列分析软件（VectorNTI8），对NCBI数据库中不同国家和地区发布的29株猪瘟野毒及6株疫苗毒株的E2基因序列及BVDV基因序列的相应位置进行了比较分析，设计了两对引物，外套引物扩增E2基因中目的片段，大小为806 bp，内套引物扩增大小为512 bp。经各种反应条件的优化，建立了猪瘟病毒套式RT-PCR检测方法，运用该方法对中国兽药监察所提供的19株CSFV的核酸及6种猪源常见病原的核酸样品进行检测，其结果显示：19株CSFV的核酸样品检测均呈阳性，其他样品则为阴性；该方法的灵敏度与real-time RT-PCR相当，比普通RT-PCR提高了100倍。

杨若松[8]等建立的猪瘟病毒巢式RT-PCR检测方法可以从拷贝数为102/μL的猪瘟病料中检测到CSFV，具有很高的特异性、灵敏性、复核率以及重复性，而且建立的猪瘟病毒巢式RTPCR方法的引物序列均在具有CSFV序列的保守区，具有更好的应用前景。

刘梅芬[9]等参照GenBank中公布的CSFV E2基因保守区域序列设计2对特异性引物，以CSFV总RNA为模板，优化反应条件，建立CSFV nested RTPCR方法，利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行检测，检测到19个阳性样品，并对阳性PCR产物进行克降测序鉴定，测序结果一致。结果表明：成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法，能够特异性地扩增CSFV，但对ST正常细胞对照和其他8种病原对照未扩增出任何条带，稳定性和重复性好，敏感性高，最低检测病毒含量为1 TCID50/mL，适合早期检测CSFV。

3 mPCR技术

多重PCR（mutiplex PCR）技术是PCR技术中的一种，该技术是在同一PCR管中加入多对特异性引物和多个对应的模板，之后进行PCR反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个病毒的一个片段，也可以同时扩增多个病毒的不同片段，它具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，被广泛用于各种病毒性疫病的快速诊断。

薛媛[10]针对PRRSV、CSFV和JEV的保守性基因序列，设计了3对引物用于扩增各目的基因序列，通过对引物浓度、退火温度、Mg2+浓度等反应条件的优化，建立了鉴别PRRSV，CSFV，JEV多重RT-PCR的诊断方法，其敏感性可达到CSFV 10-1pg，PRRSV 10-2pg，JEV 10-3pg级；此外，还具有较好的特异性，对CSFV，PRRSV，JEV己知阳性病料均能扩增出相应的片段，该方法为这3种病原的临床诊断与鉴别提供了可供参考的方法。

Liu[11]等建立的多重RT-PCR技术可同时也可单独检测出PRRSV、GSFV和PCV2，其特异性、灵敏性较高，检测3种病毒的灵敏度分别为2.0×104，2.5×103，6.0×102个拷贝数。

汤德元[12]等根据GenBank登录的猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪流感病毒6种常见病毒的相关保守基因序列分别设计一对特异性引物，通过对其条件的优化，建立了检测以上6种病毒的PCR/RT-PCR诊断方法，通过试验证明：该检测方法具有良好的特异性和敏感性，为检测以上6种病毒提供了参考。汤德元[13]等还针对PRRSV，CSFV和SIV等3种常见病毒的相关保守基因设计特异性引物，通过对其条件的优化，建立了3种呼吸道病毒的三重RT-PCR检测方法，实现了上述3种病毒的同步检测，能快速、准确地对临床病料进行检测，是一种实用、快速的检测方法，具有广阔的应用前景。汤德元[14]等通过比对分析GenBank中登录的CSFV和PRV的相关基因序列，分别设计可以区分CSFV与PRV及其疫苗株的5对特异性引物，建立了其多重PCR鉴别检测的方法，建立的多重PCR方法对CSFV和PRV扩增为阳性，而对PCV2、PRRSV、JEV和BVDV扩增结果均为阴性；最低核酸检测量分别为1.7×103拷贝/ μL（CSFV野毒株）、9.9×103拷贝/ μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×103拷贝/μL（Guizhou-DY）、6.9×103拷贝/μL(Bartha-K61)和5.5×103拷贝/μL(SA215)。该研究建立的多重PCR方法为从病原学方面快速鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒提供了新的技术支撑，为规模化猪场实现猪瘟与猪伪狂犬病的净化提供一种新方法。汤德元[15]通过对多重PCR反应条件的优化，以及临床应用检测，成功建立了能同时检测PRV、PCV2、CSFV和SIV 4种病毒的多重PCR方法，还建立了能同时检测PRV、PCV2、CSFV、PRRSV和SIV 5种病毒的多重PCR方法，以及能同时检测PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV和SIV 6种病毒的多重PCR方法，建立的多重PCR最低检测限均达到pg级水平，且具有较高的特异性。

冷依伊[16]等根据GenBank中登录的参考病毒株序列，选择非洲猪瘟病毒(ASFV)、水疱性口炎病毒(VSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪伪狂犬病病毒(PRV)的保守序列设计5对特异性引物，通过优化反应条件，建立了一种可以同时且快速检测以上5种病毒的多重RT-PCR检测方法，该方法对不同的细菌或病毒模板扩增结果均为阴性，特异性强；对PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少检出量分别为8.82×103拷贝/ μL、6.87×104拷贝/μL、5.71拷贝/μL、4.93×104拷贝/μL和4.32×102拷贝/μL。以上结果表明：该方法快速、灵敏、特异性强，对以上5种猪病病毒能够进行快速鉴别检测，为其临床诊断与流行病学调查提供了有效的检测方法。

王苗苗[17]等为了建立能够同时检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪细小病毒（PPV）的多重PCR，并用于猪场感染情况的动态监控以及临床诊断，根据GenBank中已发表的5种病毒的基因序列，针对CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因，分别设计了特异性引物。在建立的单项PCR基础上，通过优化反应条件，建立了能同时检测5种病毒的多重PCR，采用建立的多重PCR对127份疑似病猪的扁桃体活体组织进行检测，检出了5种病毒的存在，其中感染2种及以上病毒的样品比例为39.6%（49/127），表明该方法是一种特异、快速、灵敏、高效的病原学检测手段。

4 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。其原理是在进行PCR扩增前，加入1对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针或SYBR GreenI荧光染料，该探针或染料为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。RTFQ PCR技术通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量，不需要分离PCR产物，即能准确定量起始模板数；与普通PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化、程度高等优点。

Pérez和Lester Josué[18]等描述了一种Real-time RT-PCR方法检测CSFV，该方法是基于SYBR Green结合溶解曲线分析，在两种Real-time PCR平台进行分析和检测并相互比较，其灵敏度较高，细胞培养和血清中CSFV最低可以检测0.1 TCID50/反应，组织为1 TCID50/反应，去离子水、血清及组织中分别为1，10，100拷贝数/μL。Haines[19]等建立的多重实时RT-PCR方法能够同时检测CSFV及ASFV，同时检测的灵敏性度为100%，特异性为CSFV100%，ASFV为97.3%。

石顺利[20]根据GenBank中发表的猪瘟保守基因序列设计特异性引物和探针，成功构建了实时荧光定量PCR的反应体系和反应参数，建立的实时荧光定量PCR体系灵敏度可以达到1×102拷贝的数量级，能特异性的与牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)、羊口疮病毒和羊痘病毒的区分。饶品彬[21]建立的EvaGreen多重实时荧光PCR，经实时扩增能够产生6个目的扩增产物熔解峰，从而可同时对这六种病毒进行检测和区分。其中PCV2，PRRSV和JEV的检测极限达到100 拷贝/μL，PPV，CSFV检测极限可以达到250 拷贝/μL，PRV的检测极限可以达到500 拷贝/μL；与利用SYBR Green I多重实时荧光PCR检测相同或相关病毒比较，灵敏度高出10倍左右，具有高度特异性和良好重复性，并达到基于探针的多重实时荧光PCR检测水平。

杜冬华[22]等根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异，设计了2对特异性引物及1条TaqMan探针，以含CSFV HB株和C-株E2基因的重组质粒pBS-E2C和pBS-E2作为标准品，建立了能同时检测CSFV野毒株和疫苗株的双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法。结果表明：建立的CSFV双重TaqMan real-time PCR标准曲线Ct值与1×101～1×106拷贝/μL之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系，灵敏度达10 拷贝/μL，且特异性和重复性很好，该试验建立的TaqMan real-time PCR检测方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断及病原定量分析，将为我国CSFV野毒株感染及疫苗免疫情况的调查与分析提供高效、快速的检测手段，进而为更好的防控猪瘟的发生和流行奠定基础。

5 RT-LAMP技术

环介导等温扩增(LAMP)技术是众多核苷酸扩增技术中的一种，其基本原理是针对靶序列的6个特异部位设计4条引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。反转录介导等温核酸扩增技术是检测CSFV的一种新型核酸扩增技术，它的一系列引物是基于E2基因序列设计的，然后在63 ℃下孵育50 min进行病毒RNA的扩增，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳呈现梯形分布来判定，还可以通过直接离心扩增产物观察白色沉淀的生成并借助于专用比浊仪对结果进行判定，另外还可在扩增产物中加入SYBR Green I，根据颜色变化判定扩增结果。环介导恒温扩增检测方法是一种新兴的分子生物学检测方法，已广泛应用于多种细菌病和病毒病的检测，与其他检测技术相比，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，检测速度快、无特殊设备要求，适用于基层及现场诊断使用。

Chowdry[23]等建立并且评估一种新型结合横向流动油量尺检测CSFV的LAPM技术(RT-LAPM-LFD)，这种RT-LAMP-LFD测定法结合了CSFV RNA的有效一步等温扩增和LFD的简单性，在2～5 min内就可快速读取结果，此方法灵敏性高，特异性强，操作简单，而且检测成本低，这种RT-LAMP-LFD测定有望成为诊断猪瘟的快速、简单和经济的新技术。

何文博[24]建立了猪瘟强毒株与弱毒疫苗株的LAMP检测技术，用建立的LAMP方法和RT-PCR方法检测20份猪病料，符合率为90.91%，说明该方法是一种快速准确、特异性好、灵敏度高，适合基层使用的方法，真正实现了对病原微生物核酸的特异、敏感、高效和快捷检测，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对动物疫病多重感染的鉴别检测具有重要意义。张改平[25]等建立的猪瘟强弱毒LAMP检测方法，特异性好，比RT-PCR灵敏度高出1 000倍，且重复性和稳定性良好，为快速准确地鉴别猪瘟野毒感染和疫苗接种感染提供了有效的方法。

朱俊灵[26]等针对CSFV NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针，结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物，建立RT-LAMP-LFD检测方法，所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在，检测PRRSV，JEV，PCV2等其他病毒均为阴性；所建立的CSFVRT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg；反应快速，整个扩增反应可在1 h内完成；操作简单，不需要PCR仪等复杂的仪器，结果可经肉眼观察，应用RT-LAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高，并且操作安全、简便、快捷，可以满足基层检疫的需要。

总之，猪瘟的诊断方法较多，其中间接血凝试验（IHA）被农业部推荐为猪瘟疫苗抗体检测的主要方法，也是我国猪瘟抗体检测的经典方法，在国内得到了广泛应用，为我国猪瘟的综合防控做出了巨大贡献，但该方法敏感性低，待测血清样品需经灭活处理，增加了检测时间和检测难度，且血清的质量严重影响检测结果，误差较大，不适合准确检测猪瘟抗体水平，养殖场及广大养殖户可根据对检测结果准确程度的实际需要选择应用；猪瘟荧光抗体(CSF-FA)检测猪瘟病毒是一种灵敏性高特异好的诊断方法,该方法是用冰冻组织切片或触片的直接荧光抗体试验作为猪瘟的法定诊断方法，目前在许多国家和地区均已实行，但在基层受仪器设备和人员技术的影响；酶联免疫吸附试验（ELISA）具有微量、敏感、特异、高通量的优点，可用于猪瘟抗体水平监测，但其需要酶标仪等仪器设备，且操作人员需有一定的专业技术水平，适合具有基本试验条件的基层实验室；分子生物学的普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能对病毒进行定量；与普通RT-PCR方法相比，实时荧光定量RT-PCR具有敏感性更高、特异性更强、定量准确、全封闭反应、自动化检测、不需核酸电泳检测、高通量等优点，成为目前猪瘟病毒检测中最准确的方法，虽然该技术需要价格昂贵的仪器设备、试剂，但随着国家对动物疫病实验室建设资金投入的不断增加，实时荧光定量RT-PCR技术将逐步成为猪瘟病毒检测中最准确、适合现场应用的方法，不断为我国猪瘟的综合防控事业提供强有力的技术支持。多重RT-PCR能够同时且快速地检测出多种不同的病毒，敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景，比较节省时间，但是建立一种多重PCR诊断方法不是件容易的事情，在多重PCR反应中，引物的设计至关重要，它决定着多重PCR反应的成功与否，此外，还需要对引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度等反应条件进行优化，以确定最佳反应条件。环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法与传统CSFV诊断方法和实时荧光定量RT-PCR方法相比，该方法不需要特殊设备要求，与普通RT-PCR相比，检测时间大大缩短，灵敏度高了10倍，特别适用于基层及现场诊断使用。

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2017-05-04）

贵州省农业攻关项目资助(黔科合NY字[2014]3055 号)；贵州省科学技术基金项目资助(黔科合J 字[2013]2110 号)。

石远菊（1993-），女，贵州福泉人，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子病毒学的科研学习。

*通讯作者：汤德元（1964-），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。E-mail:tdyuan@163.com.