类风湿关节炎病证结合动物模型研究进展❋

魏艳霞，李 鑫，林 也，王莘智，李如意，余黄合，邵 峰，邝 涛，宋厚盼，蔡 雄△，黄惠勇△

(1. 湖南中医药大学，长沙 410208； 2.湖南中医药大学，长沙 410208)

【综述】

类风湿关节炎病证结合动物模型研究进展❋

魏艳霞1，李 鑫1，林 也1，王莘智2，李如意1，余黄合1，邵 峰1，邝 涛2，宋厚盼1，蔡 雄1△，黄惠勇1△

(1. 湖南中医药大学，长沙 410208； 2.湖南中医药大学，长沙 410208)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性自身免疫功能障碍疾病，其病因及发病机制尚不明确。长期临床研究表明，中医药治疗类风湿关节炎具有独特优势，加大对中医药的研究必须借助动物模型，由此构建具有中医证候特征的动物模型是关键。病证结合动物模型结合现代医学“病”和中医“证”的优势，是目前应用最广泛的中医动物模型。笔者拟对近年来RA病证结合动物模型进行综述，并对其存在的问题进行思考，以期推动RA病证结合动物模型及其证候生物学机制的研究进展。

类风湿关节炎；病证结合；动物模型；研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以关节滑膜慢性炎症反应、进行性关节骨质破坏和功能丧失为特征的自身免疫疾病[1]，其发病率和致残率高，严重影响患者的生活质量[2]。根据临床特征，属于中医“痹症”范畴，与中医古籍中所记载的“历节病”“骨痹”“顽痹”等病证相似[3]。中医药治疗讲求审证求因、辨证论治，因其多靶点、多途径的整合效应治疗RA具有独特优势，越来越受到研究者们的广泛关注。由于人体和疾病的复杂性和不可控性，临床证候研究中存在诸多未知因素，要开展证候形成机制科学内涵研究，就必须构建具有中医属性的动物模型[4]。病证结合动物模型采用中医学病因和现代医学病因或病理复合因素造模，既能体现中医辨证论治思想，又能模拟患者的临床病理特征，是目前公认的证候动物模型构建方法[5]。

本文拟对近年来痹症病证结合动物模型研究进行综述，并对其存在的问题进行思考，以期为病证结合动物模型的构建及其证候生物学机制研究提供新思路。

1 痹症病证结合动物模型研究现状

1.1 风寒湿痹病证结合动物模型

金祝秋等[6]造模第1天于大鼠右后足趾皮内注射0.1 ml佐剂，将大鼠置于深2 cm、温度5～7 ℃水中站立20 min，伴4级风力，每日1次，14 d后停止风寒湿刺激，连续观察2周后处死大鼠，取右后足踝关节做病理切片。模型组大鼠关节肿胀与正常组比较有明显差异，病理切片示模型组大鼠关节有大量中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，正常组无变化。吕爱平[7]等将大鼠置于15 ℃左右水中游泳7 min，每日1次，连续7 d，第8天给予大鼠尾部、踝部多处皮下注射0.125 ml佐剂造模，结果示大鼠关节先后出现滑膜受损和软骨损伤2个病理时期，有的甚至出现骨损伤、软骨下骨细胞变性坏死。肖长虹等[8]设计2个实验，实验1有雌雄2种大鼠，实验2仅有雄性大鼠。实验1于实验第1天大鼠尾根部、颈背部皮内多点注射II型胶原500 μg/只造模，7 d后注射200 μg/只加强免疫。造模第1天将大鼠放于造模箱，箱内环境设置为风速18 m/s，相对湿度100%，温度7～10 ℃，每日1次，每次1 h，连续9 d，第10天后每隔1 d观察大鼠关节，直至30 d实验结束。第2个实验在第1个实验基础上，于第7～9天于大鼠双后肢踝关节涂抹30 μL葡萄菌肠毒素 B(SEB)，第10天后每隔1 d观察关节炎症，直至30 d实验结束。实验1表明，风寒湿+CIA不能加重雄性鼠足肿胀，反而减轻雌性鼠足肿胀，实验2表明风寒湿+CIA+SEB能显著加重雄性鼠足肿胀,由此认为可以将雄性大鼠风寒湿+CIA+SEB模型作为风寒湿痹病证结合动物模型。刘春芳[9]先将大鼠放在自制造模箱接受风寒湿刺激，刺激条件为风速6 m/s，相对湿度100%，温度6 ℃，每日1次，每次6 h，持续15 d。第7天于大鼠尾根部皮内注射0.15 ml佐剂，第15天加强免疫，结果示风寒湿+CIA能明显加重大鼠关节肿胀。胡玲等[10]将大鼠放在自制造模箱中，箱内环境设置为温度(6±2) ℃，湿度80%～90%(超声雾化器加冰块控制)，风速6档风力，每日1次，每次刺激12 h，连续20 d。第21天注射0.15 ml佐剂造模，结果表明风寒湿+CIA能明显加重大鼠关节肿胀。镇兰芳[11]实验第1天于大鼠背部多点注射0.05 ml CⅡ造模，2周后加强免疫，同时将大鼠放在气候箱中接受风寒湿刺激，条件设为温度(6±2) ℃，湿度(90±4)%，风力3级，每日1次，每次4 h，连续30 d，结果示风、寒、湿合并可以促进大鼠发病。高慧琴等[12]在实验第1天将大鼠左后足跖部注射0.1 ml佐剂，且将大鼠放于5～7 ℃冷水中伴以3级风力，每日1次，每次20 min，连续14 d，结果示风寒湿+CIA能加重大鼠足趾部肿胀。

1.2 风湿热痹病证结合动物模型

肖长虹等[8]将温度设置为36～38 ℃，其他同上，直至30 d实验结束。结果表明,风湿热+CIA或风湿热+CIA+SEB能加重雌性大鼠关节侵蚀程度，促使滑膜内炎症细胞浸润及血管增生，但能降低雄性大鼠的发病率，故认为风湿热不宜作为雄性大鼠的造模方法。镇兰芳[11]将温度设置为(33±2) ℃，其他同上，连续30 d，结果表明风、湿、热合并可以促进大鼠发病，加重大鼠关节肿胀。高慧琴等[12]将温度设置为36～38 ℃，且在37 ℃水浴恒温热蒸汽条件下熏蒸，其他条件同上。第14天实验结束，结果示风湿热+CIA能加重大鼠足趾部肿胀。

1.3 气虚血瘀病证结合动物模型

李学荣等[13]先进行CIA造模，然后把大鼠置于14～16 ℃冷水中，每日1次，期间密切观察大鼠精神状态，大鼠自然下沉则捞出水面，置于自然通风环境中晾干。给予大鼠高脂饲料并分时段行饥饿疗法，上午8∶00给予2/3 d饲料量，晚上8∶00给予1/3 d饲料量。以上2种方法持续4 周，大鼠出现精神萎靡、嗜睡、毛发枯黄且脱落等气虚症状时行大鼠血液流变学检测，结果示大鼠血黏度较空白组升高，血清 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量均明显升高。

1.4 瘀血痹阻病证结合动物模型

李征[14]将CCP多肤抗原与弗氏完全免疫佐剂混合后，注射于大白兔双侧后肢腘窝淋巴结进行结内注射，产生类似血瘀证的病理变化。结果示CCP佐剂组相对于单纯佐剂组和正常组自身抗体含量明显增加，且血浆中具有较高水平的FPA和D-二聚体，表明免疫功能紊乱是早期类风湿关节炎发病的主要致病因素，后期出现血瘀证表现。

1.5 痰瘀痹阻病证结合动物模型

唐先平[15]造模前1周给予大鼠精炼猪油灌食，于大鼠右后足趾部注射0.1 ml佐剂造模，造模后给予高脂饲料喂养，结果大鼠同时具备佐剂性关节炎和痰瘀痹阻证特点，表明造模成功。

1.6 肾虚痹病证结合动物模型

徐世杰等[16]先切除小鼠双侧卵巢模拟肾虚，注射0.1 ml佐剂造模，结果表明切除卵巢小鼠血中的雌二醇明显下降，血清骨钙素和肿瘤坏死因子的含量明显升高，同时滑膜组织加重，软骨损伤及骨的破坏更加严重，表明卵巢切除所致的肾虚能加重小鼠发病程度。艾录景等[17]切除雌鼠卵巢，3 d后注射0.1 ml佐剂造模，雄鼠先免疫造模，第2天注射乙烯雌酚制成肾虚型痹症模型，与正常组比较切除卵巢的雌鼠发病率增加，雄鼠注射乙烯雌酚能降低发病率。王燕等[18]先摘除大鼠双侧卵巢和睾丸，再注射羟基脲制成肾虚模型，28 d后注射0.2 ml佐剂造模，制成肾虚痹病证结合动物模型，结果表明去势法、羟基脲+CIA能加重大鼠关节损伤和严重程度。吕爱平等[19]选用Wistar大鼠和DBA小鼠，Wistar大鼠由母代鼠避光饲养生殖选取，给予低钙饮食复制肾虚动物模型，大小鼠分别注射1 mg、0.5 mg CⅡ免疫造模，结果示肾虚痹症动物模型加重大鼠关节病变。寿旗扬等[20]切除大鼠双侧肾上腺制成肾阳虚动物模型，注射0.1 ml佐剂造模，结果示大鼠足容积较正常组明显增大。

1.7 脾虚痹病证结合动物模型

徐士杰等[21]第1周开始给予小鼠大黄煎液灌胃和饥饱失常法复制脾虚模型，剂量为25 ml/kg，每日1次，1周结束，饥饱失常法持续2周。14 d后于小鼠双侧足底部注射50 μg CⅡ/足复制脾虚痹动物模型，结果示脾虚痹组小鼠的小肠PP结数量较空白组及CIA组明显减少，表明脾气虚是加重痹症发病的机理之一。杜中平等[22]腹腔注射0.5 mg/kg利血平复制脾虚模型，每日1次，14 d后注射0.2 ml佐剂造模，结果示其兼具脾虚症状和痹症临床表现。肖诚等[23]第1周开始给予小鼠25 mg/kg大黄煎液灌胃和饥饱失常疗法，每日1次，灌胃持续1周，饥饱失常疗法至第9周建立脾虚证动物模型，第3周注射100 μgCⅡ造模。与单纯痹症组比较，脾虚痹证组大鼠关节肿胀、病理学改变明显，炎症因子含量明显增加。

2 痹症病证结合动物模型存在的不足及展望

病证结合动物模型是目前应用较广泛的中医药动物模型，它结合了现代医学“病”和中医“证”的优势，在单纯疾病模型基础上模拟风寒湿、风湿热、肾虚等多种不同的证候，制成痹症病证结合动物模型，具有较高的可信度和重复性[24]。该模型将宏观与微观、整体论与分析论相结合，在探讨疾病生理病理的同时，可探讨中医证候的特征[25]，为中医药动物模型的研制提供了出路，较前有很大的进步，但其仍存在许多问题，主要有以下几个方面。

2.1 造模方法不统一

动物品种有不同的选择，国外制作 RA动物模型多选用 Lewis 大鼠，国内选用 Lewis、SD 或 Wistar 大鼠，选择因人而异[26]。造模方式和造模剂量也各不相同，没有统一标准。刺激条件不统一，温度、湿度和风速没有公认的标准，刺激时间和频率各不相同，无法进行统一的比较[27]。刺激环境是人为设置，与自然界环境仍有一定差距，不能完全模拟自然界风寒湿因素，这也使得类风湿关节炎病证结合动物模型的可信度降低[17]。

2.2 评判标准不统一

目前多用的标准主要有免疫学检查，如血清TNF检测和血沉、病理切片观察和大鼠足肿胀度测量、肿胀度评分和影像学检查等，尚未形成统一的标准，无法确定动物模型是否复制成功[26]。

2.3 证候形成机制和属性判定不明确

如脾虚痹病证结合动物模型，研究者从动物造模后出现体质量下降、嗜睡少动、毛发黄等一系列表现认为，大鼠属于脾虚模型，却往往忽略临床利血平在精神神经系统、泌尿系统、呼吸系统等方面也有异常表现，这表明证型的确立具有一定主观选择性。事实上，综合以上症状在临床很难诊断为脾虚证，在动物身上则更难实现[28]。

2.4 无法复制证型的动态变化

“证”是指疾病发展某一阶段病因、病理、病性的概括，它随时间和空间的改变而改变[4]，临床根据患者不同阶段的四诊信息可确定为相应的证型。而病证结合动物模型对象是动物，无法获取四诊资料，证型始终是固定的，直接导致动物模型的重复性和依从性受到广泛的质疑，无法实现对临床证型的全面复制，这表明病证结合动物模型要实现由实验室到临床的飞跃仍有很大的差距。

综上，类风湿关节炎病证结合动物模型的研制已取得初步成果，较前有很大进步，但仍需广大研究者们继续探索。一个成功的病证结合动物模型必须达到如下要求：一是病因所造证候的主要形成病因，二是病因所致的病理表现是所研制证型的证候特征。以上要求都是基于人与动物生理病理一致的基础上制定的。由于人和动物的种属差异，人体的证候规律在动物机体上只能进行一定程度的模拟，不可能完全复制。由此，采用临床标准作为实验动物造模成功与否的条件缺乏可行性[29]。其次，类风湿关节炎病证结合动物模型是基于现代医学的“病”和中医的“证”，类似于“1+1”的模式[30]。然而目前我们所研制的病证结合动物模型只是病和证的简单相加，效果类似于“1+1=1”甚至是“1+1<1”，对应于中西医结合临床所达到的成效是远远不够的。因此，未来病证结合动物模型的研制要深入病证结合机制、演变规律的研究，真正做到病证同塑，更好地服务于临床。

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ResearchProgressonAnimalModelwithRheumatoidArthritisofIntegratedDiseaseandSyndromeinTCM

WEI Yan-xia1, LI Xin1, LIN Ye1, WANG Shen-zhi2, LI Ru-yi1, YU Huang-he1, SHAO Feng1, KUANG Tao2, SONG Hou-pan1, CAI Xiong1△, HUANG Hui-yong1△

(1.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHunanMedicalUniversity,Shangsha410208,China)

Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune disorder diseases, its etiology and pathogenesis are not clear. The long-term clinical research shows that traditional Chinese medicine has unique advantage about rheumatoid arthritis, to increase the research of Chinese medicine, we must use the animal model. The key is to establish an animal model with characteristics of TCM syndromes. The integrate of disease and syndrome animal model Combines the advantages of “disease“in modern medicine and “syndrome” of traditional Chinese medicine, its currently the most widely used animal models of TCM. The author intends to promote research progress of RA animal model with integrate of disease and syndrome in TCM and biological mechanism of syndrome.

Rheumatoid arthritis; Integrate of disease and syndrome in TCM; Animal model; Research progress

R593.22

A

1006-3250(2017)10-1485-04

国家自然科学基金资助项目(81373540)-基于PI3K-Akt-mTOR信号传导通路探讨青风藤配伍白芍治疗类风湿关节炎“相使”为用的机理；湖南省高层次卫生人才“225”工程医学学科骨干人才培养对象项目；湖南中医药大学中医诊断国家重点学科开放基金项目(2014-08)-基于悬液芯片技术的RA寒湿痹阻证生物标志物及证候诊断模型研究；基于代谢组学的类风湿关节炎风寒湿痹证病证结合模型证候生物学基础研究(2015ZYZD05)；类风湿关节炎活动期中医证素及其与病理改变的关系研究(2015ZYZD15)；湖南中医药大学“科技创新团队”资助项目(201503)-风湿免疫疾病中医药诊治转化医学研究

魏艳霞(1991-)，女，湖南邵阳人，在读硕士，从事风湿免疫系统疾病的中医辨证与方证转化医学研究。

△通讯作者：蔡 雄，教授，博士研究生导师，从事风湿免疫系统疾病的中医药基础与转化医学研究，E-mail: caixiong@hnctcm.edu.cn; 黄惠勇，教授，博士研究生导师，从事中医辨证学与数字中医药的研究, E-mail: huanghy@hnctcm.edu.cn。

2017-02-17