猪大肠杆菌的分离鉴定与耐药性试验

（江苏宿迁市宿豫区畜牧兽医站，江苏宿迁 223800）

1 实验材料

1.1 病料

无菌采取天蓬养殖场患黄白痢仔猪肛试子4 份，分别编号为1～4 号；无菌采取农家乐养殖场患黄白痢仔猪肛试子4 份，分别编号为 5～8 号，无菌采取圣天养殖场患黄白痢仔猪肛试子4 份，分别编号为 9～12号。

1.2 培养基

普通营养琼脂，伊红美兰培养基、普通营养肉汤，麦康凯培养基、三糖铁培养基均购自浙江微生物试剂有限公司。

1.3 试剂和材料

定型血清12种大肠杆菌O抗原单因子血清，购自中国兽医药品监督所。试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，生化试管、药敏纸片购自广东省某军区后勤部，蛋白胨水溶液，甲基红试剂，V-P试剂均按兽医微生物学及免疫学指导的方法配置。

1.4 仪器

电子显微镜，恒温箱，高压锅，离心机冰箱，电子天平等。

1.5 实验动物

健康小白鼠（30～35g）50 只，购自中国科学院上海实验动物中心。

2 方法

2.1 病原分离

将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后分别接种于麦凯恩琼脂平板和伊红美兰琼脂平板上。37℃ 需氧培养 24 h 后，观察其生长情况，形态和颜色，革兰氏染色，显微镜检查。

2.2 再接种

再接种于血清肉汤，纯化后放置 4℃，冷藏备用。

2.3 纯化培养

从麦康凯培养基挑取砖红色单个疑似菌落或从伊红美兰培养基上挑取紫黑色、带金属光泽闪亮点疑似菌落，接种于普通培琼脂养基上37℃ 需氧培养 24 h。

2.4 生化试验

随机抽取上述分离菌培养物 3#、8#、12#，分别接种于蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖等乳酸糖化管中做乳酸糖化实验37 ℃培养24 h后，观察其对糖的利用情况。同时，各菌株做三糖铁试验，柠檬酸试验，甲基红试验，V-P试验，运动力试验等。

2.5 致病性试验

将上述生化反应已鉴定为大肠杆菌的疑似菌株，分别接种于普通肉汤37 ℃培养24 h备用，取健康小白鼠随机分3组，每组3只/珠，另取3只作为对照组；实验组小白鼠每只腹腔注射0.2ml疑似分离珠肉汤培养液，对照组注射无菌肉汤，两组隔离观察饲养，每6 h观察1次，并做好记录。

2.6 致病力及保护力试验

2.6.1 菌落形成单位的测定

（1）将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭菌过的培养皿内，每皿约 15 ml 培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，10 min 后，盖好皿盖。（2）将培养皿倒置于 37 ℃培养 24 h后，观察菌落情况，统计菌落数。（3）如果每个皿内菌落不超过4 个，则可以认为无菌程度良好，菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，再重复以上步骤。

2.6.2 致病力试验

无菌吸取上述血清肉汤培养物（含菌量5.0×108CFU/ml）以0.1 ml/只、0.2 ml/只、0.3 ml/只、0.4 ml /只、0.5 ml/只分别腹腔注射小白鼠 2 只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共 12 只，分 6组。第一组，每只小白鼠注射 3# 菌 0.2 ml，第二组每只注射 8#菌0.2 ml，第三组每只注射 3#、8#菌各0.1 ml，第四组每只注射 12#菌 0.2 ml，第五组每只注射 8#.12#菌 各0.1 ml，第六组每只注射无菌血清肉汤 1.0 ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。

2.6.3 保护力试验

将 3#、8#、12#血清肉汤培养物分别接种于 18 cm 琼脂平板。37 ℃培养 24 h 后，收菌。再用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用 0.3% 甲醛灭活，37℃作用 24 h后做无菌检验。然后将其分别腹腔接种小白鼠 2只，剂量为 0.4 ml/只。10 d后，再分别进行人工感染，剂量为 0.2 ml/只。

2.6.4 细菌回收试验

对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。

3 结果

3.1 分离细菌的培养特性及形态特征

3.1.1 培养特性

37 ℃培养 24 h 后，所采的 12 份病料在麦康凯琼脂平板上形成砖红色圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐直径为1.5～2.5mm的小菌落，伊红美兰琼脂培养基上形成紫黑色、带金属光泽闪亮点菌落。在普通培养基上易于生长，形成光滑、湿润、灰白色菌落，对碳水化合物发酵能力强。

3.1.2 形态学观察

小肠内容物培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阴性两端钝圆中等大小杆菌，多单在，偶有两、三个连在一起，有鞭毛，无芽孢。根据以上特征可初步判断为猪大肠杆菌。

3.2 生化试验结果

全部菌株均能迅速分解葡萄糖与甘露醇（产酸），2%的菌株只产酸而不产气，一般分解甘露醇的产气量比分解葡萄糖的产气量要多。90%以上的菌株分解阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖一般都在24h内分解，90%以上的菌株不分解福寿草醇和肌醇。

3.3 致病力试验结果

实验组在腹腔注射12h后十组小白鼠均出现不同程度的精神沉郁，被毛脏乱，反应迟钝，6h后开始出现陆续死亡，3组在6～24h内死亡其余7组在24～48h内全部死亡，对照组在72h后继续健康存活，无菌操作取病死小白鼠肝、脾涂片镜检为革兰氏阴性杆菌，将病料接种肉汤收获到与攻毒组相同的特征的大肠杆菌，对照组全部健康存活，以此说明此次分离的大肠杆菌对小白鼠都有不同程度的致病作用，其中，有三组致病力较强。

3.4 保护力试验结果

经观察接种后的三组小白鼠，48h有一组发病，但症状轻微经过良好，其他两组72 h均健康存活，无临床症状，由此其保护力效果明显。

3.5 细菌回收试验结果

将上述死亡及发病的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验及血清学鉴定，能得到原分离菌。

4 分析和讨论

4.1 病原体

本研究对我们本地区发病猪群的病料进行了细菌分离鉴定，结果判定为大肠杆菌，并证明该猪群为猪大肠杆菌感染引起的猪大肠杆菌病，且毒力较强。药敏试验结果表明，该菌株对不同的药物敏感性存在一定的差异，但总体来说，对其敏感的药物较多。

4.2 试验动物

通过动物攻毒试验发现大肠杆菌对小白鼠具有较强的致病作用：小白鼠的发病率为100%，死亡率100%。当然，不同血清型的致病力也有可能随着发病地区、猪群品种等的不同而存在差异。一周龄以内的初生仔猪感染时多呈急性肠炎，腹泻，排黄色液状粪便、死亡迅速、发病率、死亡率很高；10至30日龄感染时，表现为突然发生腹泻排出乳白色或灰白色糊状粪便且腥臭粘腻，虽死亡率不高，但容易形成僵猪。

4.3 防治

血清学鉴定结果显示所分离菌株为大肠杆菌，对该株大肠杆菌血清学试验鉴定已鉴定出型，但不同地区又有不同的血清型，同一地区不同猪群的血清型可能相同也可能不同。由于大肠杆菌不同血清型之间的交叉保护率低，因此，针对不同发病地区应选择与该地区相对应的血清型或含有相同血清型的猪大肠杆菌疫苗（即单一或多价疫苗）进行免疫预防接种，才能起到有效的预防效果。

4.4 药敏试验

药敏试验结果证明，本次分离到的大肠杆菌对多种药物具有很强的敏感性。本次检查结果看耐药性较高的抗生素主要是兽医临床使用率较高的喹唑酮类、青霉素类、氯霉素类等，这可能由于猪场疾病的原因大量使用这些药物进行药物预防或在饲料中长期大量添加抗生素，由此提示临床上尽量避免使用此类药物，可使用多粘菌素、呋喃类药物，这可能与猪场在临床上不经常使用这些药物有关。

综上所述，本研究试验结果对疑似猪大肠杆菌病进行了确切诊断，并为有效防治该病提供了科学依据和有利条件，对指导养殖生产具有重要意义和应用价值。由此也可以说明在我区的部分中小型猪场中因长期滥用抗生素已经产生较为严重的后果，导致耐多种药物及耐药谱相似的菌种在快速增加，对今后猪场在应对此类疫病诊治提供具有一定的临床参考价值。

[1]李健强.兽医微生物学实验与实习指导[D].西北农业大学，2016

[2]张彦明，贾靖国，刘安典.动物性食品卫生检验技术[M].西北大学出版社，1999.