药用野生稻胚拯救后代YF2快繁技术

王 芳，原文霞，鲍根良，钱长根，黄 坚，刘 健，杨 勇，严成其，陈剑平*

(1.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040； 2.嘉兴职业技术学院，浙江 嘉兴 314000;3.浙江省农业科学院 浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021)

药用野生稻胚拯救后代YF2快繁技术

王 芳1，原文霞3，鲍根良3，钱长根2，黄 坚1，刘 健1，杨 勇3，严成其3，陈剑平3*

(1.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040； 2.嘉兴职业技术学院，浙江 嘉兴 314000;3.浙江省农业科学院 浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021)

取药用野生稻胚拯救后代的幼芽1～2 cm，经70%酒精消毒30 s，0.1%升汞摇动消毒8 min及无菌水洗3～5次后，将其放在诱导培养基MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1中培养，胚性愈伤组织的诱导率为31%；然后转入MS+IAA 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 2.0～4.0 mg·L-1+KT 1.0～2.0 mg·L-1分化培养基中培养，成苗率为62%。成苗后转入1/2 MS+IAA 0.02～0.5 mg·L-1生根培养基中，生根率达到99%。炼苗7 d后移栽到苗床，成活率达到90%。短期内可实现胚拯救后代YF2组培苗健康及快繁生长，为创制水稻新种质和研究抗病虫新基因克隆和利用奠定基础。

药用野生稻； 胚拯救； 组织培养； 快繁

野生稻是一种宝贵的自然资源，它含有栽培稻所没有的或已经丢失的丰富的优异基因，药用野生稻是我国现存的3种野生稻之一，前期研究结果表明，药用野生稻对灰飞虱具有很强的抗性和排驱性[1-4]。由于药用野生稻和普通栽培稻分属不同物种，药用野生稻染色体组CC型，栽培稻染色体组AA型，用常规的有性杂交方法不结实[5]。为了充分利用药用野生稻资源，课题组采用药用野生稻和栽培稻通过胚拯救技术获得了胚拯救后代YF2，实现药用野生稻的遗传物质向栽培稻转移。为挖掘具有自主产权的高产、优质、抗病、抗逆、养分高效等重要优良品种资源奠定基础[6-8]。

但是在具体的研究中缺少遗传背景一致的药用野生稻胚拯救后代，难以进行抗性基因的研究和新种质的育种利用，组培快繁技术增殖速度快，生产周期短，繁殖系数高，可在短期内实现遗传性一致的药用野生稻胚拯救后代规模化生产。

1 材料与方法

1.1 材料

药用野生稻胚拯救后代YF2来源于浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所温室。

1.2 方法

1.2.1 材料的采集与消毒

取药用野生稻胚拯救后代YF2幼芽1～2 cm，经70%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞加1滴，摇动消毒8 min，然后无菌水洗3～5次。

1.2.2 愈伤组织的诱导和胚性细胞的形成

取消毒后的药用野生稻胚拯救后代YF2幼芽，剪成0.1～0.2 mm，置于诱导培养基上诱导愈伤组织。通常每隔3周挑选胚性愈伤组织或质量好的愈伤组织进行继代培养。预培养、诱导和继代培养基均为MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1，在(25±2)℃暗培养。适量增加糖、琼脂的浓度，并添加谷氨酰胺。部分非胚性愈伤组织能诱导胚性愈伤组织。

1.2.3 胚性细胞分化成小苗

将诱导出的胚性细胞接种在MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 2.0～4.0 mg·L-1+KT 1.0～2.0 mg·L-1分化培养基中培养，培养条件为温度(25±2)℃，光强2 000～3 000 lx，光照16 h·d-1。

1.2.4 生根培养

将小苗接种于1/2 MS+IAA 0.3～1.0 mg·L-1培养基，置于25 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间16 h·d-1的环境中培养，30 d后统计植株高度、叶片数、根数等生长情况。

1.2.5 炼苗及移栽

待小苗在培养基中长至10 cm后，直接打开培养瓶盖，加入少量纯净水，水量以高过培养基2 cm为宜，定时观察续水；7 d后用温水将小苗充分洗净，然后置于内含10 mL 1/2 MS+0.3 mg·L-1IAA水溶液的三角瓶中，7 d后移栽到苗床。苗床要求：移栽前充分泡水保证有机质、氮、磷、钾养分充足。移栽后覆膜保湿，7 d内每天中午揭膜透气，后期可逐步揭开，15 d后移栽至大田。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导和胚性细胞的形成

将剪成0.1～0.2 mm的药用野生稻胚拯救后代接种到MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1诱导培养基中培养。1个月后不同程度地诱导出愈伤组织，初次诱导出的愈伤组织，有些是非胚性的。若继代培养基中糖和琼脂的浓度分别超过35、9 g·L-1，同时添加350 mg·L-1谷氨酰胺，能使部分愈伤组织转变成小颗粒状、易碎的胚性愈伤组织。

在同一培养基连续培养2个月左右能诱导出胚性愈伤组织，继续培养可建成分散性好、色泽鲜黄、细胞质浓、具有旺盛分裂能力的胚性细胞。其中，最佳诱导胚性细胞的配方是MS+2.5 mg·L-12, 4-D+0.3 mg·L-16-BA，诱导率达到31%。

2.2 不同激素浓度对胚拯救后代胚性细胞再生苗的影响

设10组含有不同浓度激素的MS培养基，每组培养基接50个胚性细胞，60 d后观察结果(表1)。结果表明，MS+0.5～4.0 mg·L-1IAA+0.5～4.0 mg·L-16-BA+0.5～2.6 mg·L-1KT均可诱导成苗，成苗率达到4%～62%，其中最佳培养基配方为MS+3.0 mg·L-1IAA+3.0 mg·L-16 BA+2.0 mg·L-1KT，其成苗率可达62%。

2.3 生根培养

将再生的小苗接种至1/2 MS+1.0～3.0 mg·L-1IAA培养基中培养，均能长出根茎叶完整的水稻植株，30 d后生根率达到99%，但是生长在1/2 MS+1.0 mg·L-1IAA培养基的水稻再生植株徒长，最佳的生根培养基应该是1/2 MS+3.0 mg·L-1IAA。

2.4 炼苗及移栽

由于组培苗在形态和生理结构上与自然生长苗存在一定差异，为了适应移栽后的自然环境，需要由异养逐步过渡到自养，生长环境由无菌变为有菌，温光条件也发生显著变化。

研究表明，炼苗7 d后，10～15 cm的再生小植株直接移栽到保持湿度的苗床中，1周后成活率达90%。

3 小结与讨论

植物生长调节剂是影响水稻愈伤组织诱导和胚性细胞形成的关键因素之一，2, 4-D是诱导水稻组织产生愈伤组织不可缺少的关键激素成分。但是，当2, 4-D浓度大于4 mg·L-1或小于1 mg·L-1时都不利于水稻拯救后代愈伤和胚性细胞的形成。已建成的胚性细胞，继代时间过长时，胚性会减弱，表现为部分细胞团开始解体，细胞团周边细胞的表面变得粗糙，出现不规则颗粒状突起，甚至有非胚性的细胞。初次诱导出的愈伤组织，有些是非胚性的，若继代培养基中糖、琼脂的浓度大于35和10 g·L-1，同时添加350 mg·L-1谷氨酰胺，能使愈伤组织转变成小颗粒状、易碎的胚性愈伤组织。愈伤组织的色泽、外表对再生频率有影响，一般色泽浅白、花菜形状、结构紧密的胚性愈伤组织容易变绿，长出绿芽。小植株在移栽之前必须经过炼苗，苗床炼苗时间不宜过长，否则组培苗生长过大、根系过长，移栽至大田时容易构成二次损伤。

[1] 魏兴华. 浙江省稻种资源的保护与利用[J]. 浙江农业科学, 2015, 56(5): 727-729.

[2] 胡婷婷, 王健康, 丁成伟, 等. 粳稻花培苗移栽技术及田间管理措施[J]. 江苏农业科学, 2015, 43(7): 79-80.

[3] 董岩, 钱长根, 张维林, 等. 药用野生稻体细胞杂交后代对条纹叶枯病的抗性鉴定[J]. 生物技术通讯, 2013 (5): 682-684.

[4] ZHANG W, DONG Y, YANG L, et al. Small brown planthopper resistance loci in wild rice (Oryzaofficinalis)[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2014, 289(3): 373-382.

[5] 翁锦屏, 谢关林, 诸葛根樟,等. 浙江省水稻白叶枯病病菌区系分布及其分化的研究[J]. 浙江农业科学, 1985 (2): 70-76.

[6] 陈剑平, 袁群英, 孙丽萍. 依靠科技进步提高浙江省粮食生产能力的对策建议[J]. 浙江农业科学, 2014 (9): 1317-1322.

[7] YAN C Q, QIAN K X, YAN Q S, et al. Use of asymmetric somatic hybridization for transfer of the bacterial blight resistance trait fromOryzameyeriana L. toO.sativaL. ssp.japonica[J]. Plant Cell Reports, 2004, 22(8): 569-575.

[8] ZHANG W, LING Y, MEI L, et al. Omics-based comparative transcriptional profiling of two contrasting rice genotypes during early infestation by small brown planthopper [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(12): 28746-28764.

(责任编辑：侯春晓)

2017-01-20

浙江省自然科学基金(2014C140001)；浙江省重大攻关高产优质多抗水稻新品种选育项目(2012C12901-2)；宁波市重大科技项目(2016C11017)

王 芳(1981—)，女，浙江宁波人，农艺师，从事良种生物育种与推广工作，E-mail: wangfang811028@163.com。

陈剑平，研究员，博士，E-mail: jpchen2001@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170430

S511

B

0528-9017(2017)04-0642-02

文献著录格式：王芳，原文霞，鲍根良，等. 药用野生稻胚拯救后代YF2快繁技术[J].浙江农业科学，2017，58(4)：642-643，647.