自制沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸检测试剂的性能评价

王伟伟周林福钟 磊*

（1 浙江大学医学院医学生物技术研究室，浙江 杭州 310058；2 桐乡市中医医院，浙江 桐乡 314500）

自制沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸检测试剂的性能评价

王伟伟1周林福1钟 磊2*

（1 浙江大学医学院医学生物技术研究室，浙江 杭州 310058；2 桐乡市中医医院，浙江 桐乡 314500）

目的评价自主开发针对婴幼儿感染的沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体的多重核酸检测试剂的性能。方法采用荧光定量PCR仪，进行准确度、灵敏度、最低检测线及稳定性的性能评价，与金标准测序进行对比。结果通过临床样本检测，对比金标准测序法，自主研发的试剂盒操作具有灵敏度高、准确高、特异性强等特点。结论试剂盒的指标基本达到了国内临床诊断试剂所要求的主要性能指标，可以满足临床样本的诊断，是一种值得推广的诊断试剂。

沙眼衣原体；肺炎衣原体；肺炎支原体；荧光定量PCR；检测试剂

肺炎衣原体（chalamydia pneumoniae，C.pn）属于严格的人类病原体，传染途径是呼吸道分泌物，扩散较为缓慢，潜伏期长（平均30 d），其感染可引起呼吸系统疾病，如肺炎、咽炎、喉炎、支气管炎等。肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是一种常见的呼吸道病原体，通常导致轻微的上呼吸道感染，如喉咙痛、咽喉炎和气管炎，其引起的肺炎占非细菌性肺炎的50%，还可引起肺外并发症，其潜伏期较长（2～3周），通过飞沫以气溶胶形式传播，存留在鼻、喉、气管和痰液中，密切接触可能引起肺炎支原体的暴发。沙眼衣原体（chlamydia trachomatis，CT）引起多种疾病，如沙眼，人类泌尿生殖道疾病，还可以通过母婴传播新生儿眼结膜炎、肺炎，并可导致胎膜早破、早产、新生儿死亡等，也是导致婴儿下呼吸道感染及黄疸的主要原因之一[1-2]。

本研究采用荧光PCR技术检测沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸，操作简便、检测迅速、检出率高，通过一次试验即可明确是否属3种病原体感染及何种病原体感染，有利于疾病的及时诊断及合理选择治疗方案，与传统分离培养技术及血清学等检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率。

1 材料与方法

1.1 仪器：ABI7500实时荧光定量PCR仪。

1.2 试剂：自主研发的沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体检测试剂盒，采用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman荧光探针，对人痰液样本中沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体核酸进行定性检测。

1.3 临床样本：本研究所采用的儿童痰液样本由浙江大学医学院附属儿童医院提供；带状疱疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒为病毒培养物，由浙江疾病预防控制中心提供；链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌为临床阳性样本，由浙江大学医学院附属儿童医院提供；HCV为临床阳性样本，由浙江大学医学院附属第二医院提供；HBV为临床阳性样本，由浙江大学医学院附属第一医院提供。

1.4 测定方法：采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，设置条件为50 ℃、2 min使UNG酶发挥作用；95 ℃、2 min进行预变性；91 ℃、15 s，58 ℃、60 s，共进行40个循环，在58 ℃、60 s阶段收集荧光信号。

1.5 灵敏度分析：将Ct值相差2以内的沙眼衣原体阳性样本、肺炎衣原体阳性样本和肺炎支原体阳性样本等体积混匀，采用生理盐水进行10倍梯度稀释，分别稀释10倍和100倍，将试剂每一梯度进行10次重复检测。实验在ABI7500仪器上进行，以分析产品的灵敏度。

1.6 最低检测限确认：抽提质控品的质粒DNA，Nonadrop仪器测DNA的浓度，换算得到拷贝数，将此DNA进行10倍梯度稀释后进行扩增，制备标准曲线，通过标准曲线，得到临床样本中病毒载量。将各样本浓度稀释至500 copies/mL左右，对此浓度的样本进行10次重复检测。

1.7 准确度分析：采用与金标准测序的方法来验证试剂的准确度，选择沙眼衣原体样本、肺炎衣原体样本和肺炎支原体样本各3例，将本自主研发的试剂和测序进行比对，进行准确度分析。

1.8 特异性分析：本试剂在ABI7500仪上进行试验，检测临床阴性样本，另检测具有相同感染部位或相似临床症状的病毒样本，如疱疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌等。

1.9 精密度分析：将Ct值相差2以内的、较低浓度的沙眼衣原体阳性样本、肺炎衣原体阳性样本和肺炎支原体阳性样本等体积混匀，用该自主研发的试剂对此混合样本进行10次重复检测，计算变异系数，以确定批间和批内精密度。

1.10 抗干扰试验：本试剂在ABI7500荧光定量PCR仪上，对痰液样本中可能存在的干扰物质进行了验证试验。

根据中华医学会呼吸病学分会发布的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》。目前，对于支原体和衣原体的感染治疗，临床应用较多的药物是大环内酯类、喹诺酮类和β-内酰胺类，因此，选用阿奇霉素、阿莫西林和罗红霉素作为可能存在的治疗药物进行验证，药物浓度分别为0.15 g/L、0.2 g/L、0.03 g/L。另，选择样本中较常见的异常病理成分血和脓液进行验证试验，即在样本中添加10%的血清和5%的脓液进行抗干扰试验。

1.11 四色荧光相互干扰试验：本试剂需要采用FAM、VIC、CY5和ROX四种荧光进行实验。其中，CY5指示内标，FAM荧光指示沙眼衣原体（CT），VIC荧光指示肺炎支原体（MP），ROX荧光指示肺炎衣原体（CP）。为验证4种荧光之间是否存在相互干扰，采用该试剂在ABI7500荧光定量PCR仪上进行验证试验。

2 结 果

2.1 灵敏度分析：本试剂使用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，当样本的Ct值＞35左右时，10次重复不能100%检出阳性。

2.2 最低检测限确认：将各样本浓度稀释至500 copies/mL左右，对此浓度的样本使用试剂在ABI7500荧光定量PCR仪进行10次重复检测，检测结果表明，10次重复能够100%检出。

2.3 准确度分析：将选择的每个病原体阳性样本3例，使用试剂在ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，然后样本经过测序所得序列经Blast比对，样本对应的肺炎衣原体、肺炎支原体还是沙眼衣原体，与试剂检测结果符合率100%。

2.4 特异性分析：本试剂分别在ABI7500荧光定量PCR仪上进行试验，检测50份临床阴性样本，阴性符合率是100%，另检测具有相同感染部位或相似临床症状的病毒样本，如疱疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌等，检测结果均是阴性。

2.5 精密度分析：选用三批试剂，对内标、CT、CP和MP分别进行检测，重复10次，计算平均值、标准差、批内精密度、批间精密度。检测结果统计得出，批间变异系数在3.25%～7.64%，批内变异系数在0.58%～2.12%，说明了本试剂盒具有良好的批间和批内精密度。

2.6 抗干扰试验：临床样本均为痰液样本，将不添加任何物质的样本的原始样本，分别添加血液、脓液、阿奇霉素、罗红霉素和阿莫西林[3-4]。计算添加了干扰物的样本的检测值与原始样本的检测值之间的平均值。从结果可以看出，0.15 g/L的阿奇霉素、0.2 g/L阿莫西林、0.03 g/L罗红霉素、10%血清和5%脓液对试验结果均没有显著影响。

2.7 四色荧光相互干扰试验：将Ct值相差2以内的肺炎支原体阳性样本、肺炎衣原体阳性样本和沙眼衣原体阳性样本等体积混合后进行检测，单一样本用2倍体积同类型阴性样本稀释后检测。各种不同浓度梯度的样本混合后进行检测，与单一样本检测之间的CV值在6%以内，表示没有显著差异，即各种荧光之间没有干扰。

3 讨 论

自开发的试剂，通过临床样本检测，对产品性能进行评价，自主研发的试剂盒操作具有灵敏度高、准确高、特异性强等优点，达到了国内临床诊断试剂所要求的主要性能指标，可以满足临床样本的核酸诊断，是一种值得推广的诊断试剂。

[1] Khan ER,Hossain MA,Paul SK,et al.Molecular diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infection by polymerase chain reaction[J].Mymensingh Med J,2011,20(3):362-365.

[2] Maass V,Kern JM,Poeckl M,et al.Sequence Homologies between Mycoplasma and Chlamydia spp.Lead to False-Positive Results in Chlamydial Cell Cultures Tested for Mycoplasma Contamination with a Commercial PCR Assay[J].J Clin Microbiol,2011,49(10):3681-3682.

[3] Brittain-Long R,Andersson LM,Olofsson S,et al.Seasonal variations of 15 respiratory agents illustrated by the application of a multiplex polymerase chain reaction assay[J].Scand J Infect Dis,2012,44(1):9-17.

[4] Thurman KA,Warner AK,Cowart KC,et al.Detection of Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia pneumoniae,and Legionella spp.in clinical specimens using a single-tube multiplex real-time PCR assay[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,70(1):1-9.

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1671-8194（2017）20-0031-02

*通讯作者:E-mail: 1533084114@qq.com