核磁共振氢谱与化学计量学相结合鉴别麦卢卡蜂蜜

核磁共振氢谱与化学计量学相结合鉴别麦卢卡蜂蜜

近年来，麦卢卡（Manuka）蜂蜜由于其优越的抑菌活性和特殊的口味在国际蜂蜜市场上独树一帜。麦卢卡树是一种只生长在新西兰和澳大利亚部分地区的灌木，而麦卢卡蜂蜜主要产自新西兰。据估算，目前全世界销售的麦卢卡蜂蜜是新西兰真实产量的3倍以上。由此可见，麦卢卡蜂蜜造假现象已非常严重。因此，迫切需要一种可靠的检测体系来对麦卢卡蜂蜜进行质量控制。而目前在世界范围内已获得广泛认可的蜂蜜掺假检测技术是碳同位素方法检测碳4植物糖。很显然，这种方法并不适合麦卢卡蜂蜜的真伪鉴别。为此，法国学者Spiteri M.和新西兰学者Rogers K.等合作，采用核磁共振氢谱（1H NMR）与化学计量学相结合的方法，对264个来自新西兰和澳大利亚的蜂蜜样品进行分析研究，利用核磁共振氢谱鉴定了麦卢卡蜂蜜的核磁共振新标识物-独麦素（Leptosperin），并对Leptosperin、甲基乙二醛（MGO）和二羟基丙酮（DHA）进行量化，建立偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）模型来鉴别麦卢卡蜂蜜，取得良好的效果，其正确率达89%。

DHA和MGO作为麦卢卡蜂蜜的标识性物质，其中DHA在成熟和贮藏过程中不断地转变为MGO，MGO则是麦卢卡蜂蜜强抑菌活性的主要因素。之前也有学者从成分角度去鉴别麦卢卡蜂蜜和其他蜂蜜的研究，但方法较为复杂，往往需要结合多个技术同时进行。Spiteri M.等利用独立成分分析（ICA）确定蜂蜜样品的鉴别信号：在2.30 ppm和1.38 ppm处分别出现两个MGO的独立信号峰，在4.41 ppm处出现一个DHA信号源。验证发现，麦卢卡蜂蜜确实含有较高的MGO和DHA，但非麦卢卡蜂蜜中也含有部分的DHA和MGO，这可能是由于蜜蜂采集多种花蜜导致蜂蜜不纯所致。由于MGO和DHA可以人为添加，因此需要寻找其他信号来提升准确度。研究发现，在芳香区7.42 ppm处发现的单峰与MGO和DHA相关性很高。将这个特征峰与3,4,5-三甲氧基苯甲酸和丁香酸甲酯这两种物质的峰进行对比，结果发现它们并不匹配。猜测此峰也许是2012年就被Kato等人报道过的麦卢卡蜂蜜特征标志物Leptosperin的变形峰。于是，他们利用核磁共振氢谱分析Leptosperin后，在7.34 ppm处发现一个单峰，但与之前不同的是，此时溶解蜂蜜的溶剂是甲醇而不是水。验证发现，图谱的化学位移的确与溶剂有关。随后，他们通过核磁共振量化Leptosperin，发现与2014年Kato等人通过超高液相色谱（UPLC）获得的值保持高度一致；利用液相色谱和飞行时间质谱联用（LC-TOF）找到与Leptosperin对应的化合物；进一步将通过核磁共振氢谱进行量化的DHA和MGO值与高效液相色谱（HPLC）值比较，发现它们的相关系数分别高达0.99和0.98，表明核磁共振可准确量化这三种关键成分。

他们利用核磁共振氢谱对84种麦卢卡单花蜜和183种其他类型单花蜜的三种关键成分进行量化，结果发现，麦卢卡蜂蜜的DHA均值为1154 mg/kg，95%范围为50～2515 mg/kg；非麦卢卡蜂蜜的DHA均值为347 mg/kg，95%范围为0～1332 mg/kg。麦卢卡蜂蜜的MGO均值为672 mg/kg，95%范围为18～1555 mg/kg；非麦卢卡蜂蜜的MGO均值为233mg/kg，95%范围为0～940 mg/kg。麦卢卡蜂蜜的Leptosperin均值为784 mg/kg，95%范围为62～1556 mg/kg；非麦卢卡蜂蜜的Leptosperin均值为394 mg/kg，95%范围为0～980 mg/kg。虽然麦卢卡蜂蜜与非麦卢卡蜂蜜均值和范围存在明显差异，但依然有一些重叠部分，这可能是蜂蜜纯度不够造成的。因此，在模型建立之前，剔除100个卡努卡（Kanuka）、卡马希（Kamahi）和麦卢卡混合蜜的样品值以及45个离群值，一共122个样品参与建模。从中随机选择104个蜂蜜样品（85%）作为训练集，18个样品（15%）作为检测集，用于模型验证，从而建立一个PLSDA模型，用以鉴别麦卢卡蜂蜜和其他蜂蜜。

该研究利用核磁共振氢谱技术发现了麦卢卡蜂蜜新的核磁共振标识物Leptosperin，是一项重大的突破。而且，该研究的样本量较大且均通过多种方法进行验证，较好的重现性和特征性表明，核磁共振氢谱方法具有较高的可行性和可靠性。利用这种方法鉴定和量化麦卢卡蜂蜜的三个特征性标识物，不仅快速高效而且成本较低；再者，该技术既可明确鉴别是否存在麦卢卡蜂蜜，也可鉴别麦卢卡纯蜜和混合蜜，这有助于解决新西兰蜂蜜和澳大利亚蜂蜜混合掺假问题。同时，这一方法值得我们在其他蜂蜜质量控制研究中加以借鉴。

浙江大学动物科学学院思娟娟胡福良编译