链霉菌DrrAB外排系统的研究进展

冯振月，刘德福，刘 硕，王丽姿，崔玉东



链霉菌DrrAB外排系统的研究进展

冯振月1，刘德福2，刘 硕1，王丽姿1，崔玉东1

链霉菌产生两类重要的抗肿瘤药物阿霉素和柔红霉素，链霉菌通过ABC家族的DrrAB外排泵将这两种抗生素运输到细胞外。本文对DrrAB外排系统的结构，DrrA和DrrB蛋白的表达与相互作用以及该复合物的装配和多药外排功能的研究进展做一简要综述。

链霉菌；抗生素；DrrAB外排系统

ABC(ATP-binding cassette)超家族蛋白参与很多生物学进程，包括转移不同的分子和药物。典型的ABC家族蛋白包括两个核苷酸结合结构域(nucleotide-binding domain[NBD])和两个跨膜结构域(transmembrane [TM])[1]。微生物需要一个或更多的自身抗性基因产生抗生素，抗性基因一般情况下与抗生素产生基因位于一个操纵子内[2]。通常发现多重的而不是单一的抗性机理产生抗生素抗性。链霉菌是一个能够产生抗肿瘤药物阿霉素和柔红霉素的土壤微生物，本身对这两种抗生素产生抗性。链霉菌包括DrrAB和ric2两个抗性基因，使链霉菌对这两个抗生素产生抗性。阿霉素和柔红霉素的合成基因和抗性基因DrrAB位于链霉菌的一个基因簇内。ric2基因座不位于柔红霉素产生的基因簇内，也对柔红霉素具有抗性。目前研究的较为清楚的是DrrAB外排泵[1]。DrrAB外排泵编码一个ABC型转运体，DrrAB属于DRA家族的ABCA亚家族[3]，该转运体将这两个结构相关的抗生素排到细胞外。

DrrAB是一个典型的原核转运体,由DrrA和DrrB两个不同基因编码，DrrA属于ABC家族蛋白，包含ABC蛋白催化亚基的所有保守基序 (包括Walker A,Walker B,Q-loop,signature基序,和switch基序)，即DrrA属于ABC家族的核苷酸结合(nucleotide binding domains，NBD)的催化结构域。DrrB基因的产物是一个整合膜蛋白，与细菌的ABC转运体的膜成分同源，属于ABC家族的跨膜结构域(transmembrane domains，TMD)，包含8个跨膜α-螺旋[2]。DrrAB系统，催化功能和膜转移功能位于不同的亚基上，然而这两个亚基紧密偶联的行为使其更像一个蛋白质的两个结构域[4]。两个DrrA和两个DrrB形成一个四聚体复合物，外排阿霉素和柔红霉素。尽管这4个结构域位于两个不同的亚基上，但是这两个亚基表现出很强的结构和功能的相互依赖性。因此，核苷酸结合结构域DrrA以阿霉素依赖的模式与DrrB结合形成复合物时才结合ATP或GTP。另外如果DrrA不能与DrrB同时表达则DrrB会被完全降解[2]。

1 DrrAB外排泵的定位

大部分ABC转运体，包括P-gp(人类与肿瘤抗药性相关的ABC家族蛋白)，由两个核苷酸结合结构域和两个由6个α-螺旋组成的跨膜结构域组成，在P-gp中，这4个结构域形成一个大的170 kDa蛋白。而Drr系统包括两个亚基，DrrA和DrrB，各自具有不同的结构域[3]。一个单体的DrrA和一个单体DrrB形成的一个分子约为P-gp一半大小，DrrA包含一个核苷酸结合结构域与其他的ABC家族蛋白的通透酶同源，DrrB基因编码产物为一个8次跨膜蛋白。DrrB也与其他的ABC家族的跨膜结构域同源，DrrA和DrrB蛋白质量分别为35.5和30.6 kDa,将DrrA和DrrB基因克隆到大肠杆菌表达载体，形成pDx101质粒，转化大肠杆菌细胞，将含有该质粒细胞的细胞质和细胞膜分离，使用DrrA和DrrB抗体检测DrrA和DrrB蛋白定位。带有pDx101质粒的E.coliTG1细胞被分成细胞质和细胞膜两部分，以抗DrrA或抗DrrB血清使用WB及密度分析仪分析。结果表明大约60% DrrA蛋白是与膜结合的，转入空载体的对照细胞中，细胞质和细胞膜上都没有检测到DrrA的表达。抗DrrB血清密度仪分析结果表明92%的DrrB主要定位于膜上。使用整合膜蛋白SecY抗体，细胞质基质蛋白CAT和 EFG抗体对细胞质和细胞膜交叉污染分析表明，只有痕量的SecY位于细胞质中，表明交叉污染存在的较少。密度仪分析表明95% SecY ，9% EFG,and 11% CAT位于细胞膜部分。因此，DrrA在细胞质和细胞膜上的比例约为1∶1。对含有DrrB的细胞加热到90℃ 10min导致DrrB蛋白的大量减少，表明其膜定位特征[5]。

含有DrrA和DrrAB的总膜用1.5 mol/L尿素处理后大约90% DrrA仍然与膜结合，6mol/L尿素处理总细胞膜后检测不到DrrA，而DrrB用6 mol/L尿素抽提后仍不受影响，表明DrrB是整合膜蛋白，而DrrA是与膜上的DrrB或DrrAB结合的外周膜蛋白[3]。说明DrrA是ABC超家族外排泵DrrAB的核苷酸结合结构域，是一个外周膜蛋白，而DrrB是整合膜蛋白是该外排泵的跨膜结构域。

2 DrrA或 DrrB 蛋白的表达及相互作用

DrrA和DrrB基因克隆到大肠杆菌表达载体，形成pDx101质粒，及单独将DrrA 或DrrB蛋白插入到载体中形成pDX102和pDX103质粒，E.coliTG1细胞含有上述质粒后细胞分离细胞质和细胞膜部分。用抗DrrA 或抗DrrB抗体以WB分析，条带的亮度以密度仪分析。抗DrrA血清的WB分析结果表明DrrA在含有pDX101和pDx102质粒的细胞中表达，而含有pDX102质粒的细胞表达水平低于含有pDX101质粒的细胞。密度仪分析结果表明带有pDX102质粒的细胞DrrA的表达是带有pDX101质粒细胞的70%。用抗DrrB抗血清的WB结果表明DrrB只在含有pDX101的细胞中有表达，在含有pDX103质粒的细胞中DrrB几乎不表达[4]。带有pDX103质粒的E.coliTG1细胞与带有DrrA基因的兼容质粒pDX108共转化大肠杆菌细胞。细胞中DrrB的表达可以被反向存在的DrrA修复。表明DrrB在细胞内的表达需要DrrA蛋白的存在[4]。在含有pDX101质粒的细胞，DrrA和DrrB蛋白能被检测到。而DrrA基因亚克隆到pDX102载体上，DrrA被检测到的水平低于pDX101,表明DrrB可能影响或稳定DrrA的表达。DrrA对DrrB表达和稳定的影响似乎更强烈。DrrB基因亚克隆到pDX103载体时检测不到DrrB蛋白的表达，而pDX101,pDX102,pDX103都包含相同的启动子，那么DrrB表达的调节就应该是翻译或翻译后水平的。DrrA和DrrB在原始启动子下的翻译因其起始密码子与DrrA的终止密码子重叠而偶联[4]。进一步的实验表明同时表达DrrA,无论是在正向还是在反向，都对维持DrrB表达很关键。当以兼容质粒将DrrA和DrrB基因共同转化到相同的细胞，pDX103翻译DrrB蛋白，其水平与pDX101相似，暗示DrrB蛋白可能是翻译后水平的调节[3]。在pDX103质粒的细胞中DrrB是被翻译的，但是这个蛋白在WB上检测不到。当含有DrrA的质粒pDX108共转化，DrrB又能够被检测到其表达水平与在pDX101质粒的细胞中相当。因此有理由认为当没有DrrA存在时DrrB被降解[4]。

DrrA除调节DrrB的稳定性和膜插入功能，DrrA本身功能也依赖于与DrrB的相互作用。DrrA是一个ATP/GTP结合蛋白。ATP的结合特征以包含pDX101或pDX102质粒的大肠杆菌细胞的细胞质和细胞膜部分确定。交联实验表明DrrA只在含有DrrB的膜部分才与ATP交联。单独的DrrA不与ATP交联。使用DrrA 或DrrB抗体WB分析表明DrrA在所有情况下都可检测到，而DrrB则不是这样的，另外，检测了是否细胞内可溶性的DrrA能与ATP交联，发现即使DrrAB都表达的细胞可溶性的DrrA也不与ATP交联，只有与膜结合的DrrA与ATP交联[4]。表明DrrA与DrrB在膜上的特异相互作用诱导DrrA与ATP结合结构域的构象改变，而使其只有与膜结合时才能与ATP结合。因此如果没有DrrB尽管DrrA可以与膜结合但是却没有活性。因此，DrrB稳定的在膜上表达依赖于DrrA,而DrrA结合或水解ATP依赖于膜上DrrB的存在。在这方面，DrrAB复合物是一个典型的ABC转运体，该复合体的两个成分以相互帮助的模式存在[4]。

基于目前的数据认为DrrA是一个变构蛋白，在有或无DrrB和配体阿霉素存在时具有不同的构象，在未形成复合物时DrrA是位于构象I，该状态不能与ATP结合。与DrrB结合后使DrrA维持在细胞膜上，并使DrrA构象改变变成活化状态的II，活化状态的DrrA底物结合变成构象III,该构象是由构象II与阿霉素结合变成的。在这种构象下DrrA能够与ATP结合形成交联状态[4]。

3 DrrA与DrrB相互作用的功能位点及DrrB的拓扑结构

以前的研究认为ABC转运体的核苷酸结构域的C端不包含任何与功能或装配有关的保守基序，最近有些实验研究并报道了一些ABC蛋白的C端可能具有特殊的功能。然而C端的氨基酸序列，只在相关蛋白中才比较保守。大肠杆菌的MalKC端的基序结合MalT和EIIglc在调节表达和在诱导物排除中扮演重要功能[6]。在甲烷八叠球菌作为非糖类ABC转运体的钼酸盐/钨酸盐转运体MaModBC的调节结构域位于ModCC端[7]，这些蛋白质的晶体结构分析表明位于C端的结构域都包含一个类似β-sheet的折叠，尽管它们执行不同的转移功能和具有不同的氨基酸残基组成[2]。以MalK为模板对DrrA进行同源建模发现DrrA C端也有一个类似β-sheet的结构。并发现两个保守的基序对DrrAB复合物装配起关键作用。一个基序位于DrrA的C端富含谷氨酸残基，命名为CREEM。第二个基序LDEVFL,位于CREEM的上游。通过同源序列比对，这两个基序在原核和真核生物的ABC转运体中是保守的，尤其是在ABCA亚家族的蛋白1，2，3和8，以及Ced-7，与DrrAB一样属于ABC超家族的DRA亚家族。通过定点突变和截短突变证实DrrA的C端LDEVFL和CREEM基序在DrrA-DrrB复合物相互作用和装配上起重要作用。DrrA的C端的调节基序，LDEVFL和富含谷氨酸的调节基序(CREEM) 直接参与膜蛋白DrrB的N端胞质尾部相互作用及DrrA同源二聚体的形成。二硫化物交联分析实验表明CREEM和紧挨该基序的上游直接参与了DrrA与DrrB的N端的相互作用。LDEVFL和CREEM基序一系列突变严重影响DrrAB转运体的功能。LDEVFL基序突变也会严重影响DrrA C端和DrrB N端的相互作用以及DrrA和DrrB的共纯化，因此表明LDEVFL基序调节CREEM调节的DrrA和DrrB相互作用并在DrrAB复合物的生物起源上扮演重要作用。建模分析表明LDEVFL基序对DrrA C端构象的完整上是非常重要的，并证实DrrA C端形成一个独立的结构域[3]。DrrA的第三个结构域GATE(Glycine-loop And Transducer Element)位于NBD结构域的switch结构域的下游，包括33个氨基酸参加，这段氨基酸残基在ABC家族中比较保守，该结构域在DrrAB复合物的催化功能中起重要作用[2]。另外DrrA N端的Q-loop区域在DrrA形成同源二聚体和与DrrB形成异源二聚体中也具有重要作用[8]。

DrrB蛋白在260位点包含一个半胱氨酸，而DrrA蛋白没有半胱氨酸。通过位点直接突变的方法对DrrB第260位的半胱氨酸突变成丝氨酸。然后在没有半胱氨酸的DrrB中引入20个半胱氨酸替换。替换的半胱氨酸在DrrB中的定位是基于对DrrB的拓扑结构模型的建立，发现DrrB有8个跨膜结构域且N端和C端都位于细胞质中。为了鉴定DrrB与DrrA直接相互作用区域，使用了一个外源的半胱氨酸到氨基的化学交联试剂GMBS。研究结果显示DrrA与DrrB的C端和N端都交联，表明这两个区域都参与与DrrA的相互作用[9]。

在DrrB蛋白中鉴定了位于N端的胞质尾部的一段序列，这个序列与大肠杆菌维生素B12摄取的BtuC中已经鉴定的L-环相似。通过晶体结构分析，L-loop 基序位于BtuC的表面，而这个摄取系统的膜成分BtuD通过两个结构域与BtuC结合。发现DrrB的N端结构域与DrrA交联的序列与最近在BtuC晶体结构中鉴定的“L-loop” 基序序列相似。根据BtuCD复合物晶体结构，BtuC上的L-loop环形与ABC原件BtuD广泛的接触。已经有文献报道药物外排泵MDR1、LmrA,脂质外排泵MsbA,第1个胞质环以及CFTR的第4个胞质环中都有这个相似的序列L-loop。通过目前的研究发现DrrB胞质尾部N端的序列与L-loop相似这个区域可能是与DrrA相互作用的位点。在DrrB和BtuC,这个序列都位于这两个蛋白质的螺旋形成的胞质结构域，BtuC的L-loop与其他的输入泵的EAA loop相似[9]。进一步推测DrrB和其他的外排泵(输入泵BtuC)包括一个保守的基序由序列GE-1..A3R/K..G7组成，很可能这个基序是由位于结合蛋白依赖性的通透酶上的EAA 基序(E1AA3RALG7)修饰形成的。表明EAA基序或其修饰形成的基序位于摄取系统和外排系统中，表明这个相互作用的基序来源于一个共同的在摄取系统和外排系统还没有发生分歧的祖先。这个基序位于在DrrB的N端而不是C端。值得一提的是，这个基序位于DrrB第3个胞质环226和248位的。在三维结构中这个区域很可能与DrrB N端保守结构域相互靠近形成一个与DrrA相互作用的表面，既然DrrA和 DrrB这种结合防止DrrB被降解，因此DrrA很可能起到一个分子伴侣的作用便于复合物在膜上正确装配。另外，DrrB能精确的调节DrrA的催化活性[9]。同时基于预测工具，例如Kyte-Doolittle and Top-pred,DrrB被预测含有6个输水结构域。使用基因融合方法分析了DrrB蛋白的拓扑结构。发现DrrB包含8个跨膜结构域，并且N端和C端都位于细胞质中[10]。DrrB拓扑结构的了解可以帮助我们阐明参与DrrA和 DrrB相互作用的结构域。研究表明DrrB包含一个长的N端胞质尾部，3个胞质环和一个短的C端尾部，可能是与DrrA相互作用的位点。

4 DrrAB的多药外排功能

药物转运体分为单药转运体(特异性的转移某一类药物)和多药转运体，多药转运体能够转移结构和功能不相关的复合物。这些蛋白质的功能属于初级主动运输(属于ATP 结合盒超家族)和次级主动运输。多药抗性这种现象最早发现在肿瘤细胞，在抗药性肿瘤细胞中都发现了一个ABC型外排泵如P-gp的过表达。这些蛋白表现出可以转移上百种结构不相关的复合物，包括双亲的抗肿瘤药物，肽和荧光染料等，因此在肿瘤细胞中称为多药外排泵(MDR)。MDR也广泛的存在于细菌中：细菌中研究比较清楚的ABC家族成员包括乳酸乳球菌的LmrA和LmrCD，金黄色葡萄球菌的Sav1866及大肠杆菌的MsbA[11]。

DrrAB因为其外排阿霉素和柔红霉素的专用性质，DrrAB系统一直被认为属于单药外排泵。通过使用大肠杆菌完整细胞和内膜外翻膜泡(inside-out membrane vesicles ，IOVs)体外系统和体内证实DrrAB系统不但能够转移阿霉素也能外排两个被广泛研究的MDR底物：Hoechst 33342和溴化乙锭( ethidium bromide)。另外，也证明其他的被多药转运体广泛使用的底物(包括异搏定、长春花碱和利福平)能够以较高的效率抑制DrrAB调节的阿霉素的转移，表明他们也是DrrAB的底物。动力学研究表明阿霉素的转移可被Hoechst 33342 和利福平以竞争性方式抑制，而异搏定可以非竞争性机制抑制阿霉素的转移，表明DrrAB系统可能有超过一个药物结合位点[12]。DrrAB调节的外排能量即可以来自于ATP 或来自GTP 水解，能量不依赖于质子动力势。说明阿霉素专用的外排系统DrrAB,能够识别和转移多种药物。这个研究强调在DrrAB系统和P-gp存在共同的药物底物，表明MDR蛋白在进化中有共同的作用机理。因为P-gp和其他的MDR蛋白例如细菌的MDR蛋白，富含芳香族氨基酸残基，P-gp和细菌的 MDR蛋白分别为18%和15.4%，而单药外排泵TetA的芳香族氨基酸含量为(9.4%)。Pawagi 等提出大量的芳香族氨基酸的存在可能通过分成不同的结合位点与减少底物特异性有关。最近的三维结构研究证实P-gp的药物结合空腔是大部分由疏水和芳香族氨基酸残基组成的。有趣的是，研究发现DrrB的TM螺旋芳香族氨基酸残基含量相对较高为(15%)，与P-gp (18%)和细菌MDR protein(15.4%)芳香族氨基酸残基更接近。是否DrrB中存在的这类氨基酸残基与多药抗性有关还有待进一步研究[12]。

DrrAB系统是一个相对简单的ABC药物转运体，由两个蛋白质DrrA (催化亚基)和DrrB (整合膜亚基)装配形成。在哺乳动物的P-gp,两个催化亚基和两个整合膜蛋白结构域融合成一个单独的肽链，这可能是进化过程中的基因融合事件。DrrAB和P-gp都表现出对抗肿瘤药物阿霉素和柔红霉素的抗性：DrrAB来自于产生抗生素的有机体，P-gp在肿瘤细胞中表达[12]。DrrA和DrrB之间存在较强的相互作用。基于获得的数据，可以推测DrrAB是由两个DrrA和两个DrrB亚基组成的，排列成A1B1A2B2形式，这使DrrAB外排泵与人类的抗肿瘤外排泵P-gp结构域数量和总体结构相似，都包含两个NBD结构域和两个TMD结构域[4]。

DrrAB是一个典型的原核转运体，由两个不同基因编码，然而这两个亚基紧密偶联行为上更像一个蛋白质的两个结构域。DrrA除调节DrrB的稳定性和膜插入功能，DrrA本身功能也依赖于与DrrB的相互作用。DrrA是一个ATP/GTP结合蛋白。现有证据表明DrrA与DrrB在膜上的特异相互作用诱导DrrA ATP结合结构域的构象改变，而使其只有与膜结合时才能与ATP结合。因此如果没有DrrB尽管DrrA可以与膜结合但是却没有活性。因此，DrrB稳定的在膜上表达依赖于DrrA,而DrrA结合或水解ATP依赖于膜上DrrB的存在。在这方面，DrrAB复合物是一个典型的ABC转运体，该复合体的两个成分以相互帮助的模式存在[4]。DrrA属于ABC-2亚家族，通过对DrrAB结构和功能的阐述有望能帮助我们进一步了解ABC-2亚家族成员的功能，了解这个亚家族和其他ABC蛋白的进化关系[10]。对细菌药物外排泵DrrAB的研究和可以帮助我们加深对P-gp进化和功能的了解[5,9,13]。

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Progress in research of the DrrAB efflux system ofStreptomycespeucetius

FENG Zhen-yue,LIU De-fu,LIU Shuo,WANG Li-zi,CUI Yu-dong

(1.HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China; 2.DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,Daqing163319,China)

The bacteriumStreptomycespeucetiusproduces doxorubicin and daunorubicin,and the two widely used anticancer antibiotics. Two open reading frames,drrA and drrB,were proposed to encode for an ABC (ATP-binding cassette) type of permease that carries out export of the antibiotic ABC (ATP binding cassette)-type transporter for the exportation of these two antibiotics. In this paper,the structure,expression and interaction of DrrA and DrrB protein and the research progress of the assembly and multi drug efflux function of DrrAB are briefly reviewed.

Streptomycespeucetius; antibiotics; DrrAB efflux system

Cui Yu-dong,Email: 1016856109@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.013

黑龙江八一农垦大学校内培育课题(No.XZR2015-11)

崔玉东，Email：1016856109@qq.com

1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319; 2.黑龙江省农科院大庆分院，大庆 163319

Q93

A

1002-2694(2017)05-0454-05

2016-10-26 编辑：刘岱伟

Supported by the School Cultivation Subject of Heilongjiang Bayi Agricultural University (No. XZR2015-11)