蛋白组学相关技术在运动对骨骼肌重塑研究中的进展

蔡江瑜 艾承冲 盛旦丹 蒋佳 陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

蛋白组学相关技术在运动对骨骼肌重塑研究中的进展

蔡江瑜 艾承冲 盛旦丹 蒋佳 陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

运动对身体最直接的作用为重塑骨骼肌，但其潜在的分子机制仍不清楚。蛋白组学技术可为特定刺激物调节分子通路提供一个整体的视角，目前已在运动对骨骼肌重塑的作用机制方面取得一定进展。本文通过广泛查阅近些年来有关运动对骨骼肌重塑的蛋白组学研究报道，并进行总结分析。结果发现，可通过蛋白质分离技术结合蛋白质鉴定技术有效地检测出运动前后或运动组与安静对照组骨骼肌差异表达的蛋白质。通过运动可引起骨骼肌的适应性应答，蛋白质组会发生相应的调整。不同运动的类型、强度和持续时间以及肌纤维类型可引起骨骼肌蛋白质组的不同变化。随着现有技术的不断完善和更多新技术的产生，蛋白组学研究会为阐明运动对骨骼肌重塑及其改善健康的机制研究等做出更大的贡献。

运动；骨骼肌；重塑；蛋白组学；蛋白质组

运动锻炼对身体健康有一定益处，最直接的作用为可以重塑骨骼肌[1]。不同类型、强度和持续时间的运动锻炼可刺激相应骨骼肌发生不同的微观和宏观的适应性改变。近年来，许多学者致力于揭示运动对骨骼肌重塑潜在的分子机制。但是，目前关于其机制的研究仍不够深入。蛋白质组（Proteome）的概念是由澳大利亚Macquarie大学Wilkins和Williams在1994年提出，指由一个基因组，或一个细胞、组织内表达的所有蛋白质[2]。而蛋白组学（Proteomics）是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织基因组表达的全部蛋白质[3，4]。蛋白组学技术结合生物信息学方法可为特定刺激物对信号通路的调节提供一个整体的视角，更好地阐明运动对于骨骼肌重塑的影响。本文就蛋白组学相关技术在运动对骨骼肌重塑研究中的进展作一综述。

1 蛋白组学技术

蛋白组学技术可用于分析骨骼肌相关蛋白，通过蛋白组学分析可对肌肉的功能有更深入的了解。但是，骨骼肌包括功能多样的纤维类型，在收缩动力学、骨纤维蛋白亚型、代谢酶和线粒体密度上都有所不同[5，6]。对骨骼肌进行复杂的蛋白质组分析在方法学上仍是一个挑战，且各个肌肉之间的不同特性加大了分析的难度[7]。骨骼肌能量需求较大，许多蛋白组学研究重点关注线粒体的相关蛋白[8，9]。同时，骨骼肌分泌蛋白质组也是蛋白组学的重要研究对象，以用于发现肌肉释放的可作用于局部或全身的分泌蛋白[10]。以下概述最常用的蛋白组学方法在运动对骨骼肌重塑研究中的应用。

1.1 基于凝胶的蛋白质技术

蛋白电泳技术是蛋白质分离最常用的技术之一。二维凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2DE）是根据蛋白质在第一维中的等电点及第二维中的分子量的不同，使蛋白变性分离。2DE的优点是具有高分辨率，可分离上千种蛋白，对于分析蛋白质亚型和翻译后修饰的特性描述十分有用[4，11]。目前大部分关于运动引起骨骼肌蛋白质组改变的数据来自于2DE。Burniston[12]通过2DE结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）证实了中等强度的耐力运动可改变大鼠跖肌中15个蛋白点的表达，这些蛋白的变化表明大鼠体内代谢途径由糖酵解向脂肪酸氧化转变。Fontana等[13]利用2DE结合质谱串联法（MS/MS）研究低强度运动对肌营养不良模型小鼠（mdx鼠）股四头肌的影响，结果显示，相较于安静对照组，低强度运动组中有4个蛋白点表达有差异，其中，3个为碳酸酐酶3的亚型，显著上调；另1个为超氧化物歧化酶，显著下调。作者得出结论，低强度运动可通过阻碍氧化应激，减缓mdx鼠肌肉中细胞变性过程。但是，2DE存在诸如难以分离低丰度蛋白、极端分子量或极端等电点的蛋白质以及极酸或极碱蛋白质，重复性和灵敏度较差等问题，研究者也在寻找和开发其他新的分离方法。

双向差异凝胶电泳（two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）是1997年由Unlu等首先报道[14]。它是在2DE的基础上发展而来的一种高效的蛋白质分离方法，解决了2DE的一些技术难点[15]。这一方法是基于不同的荧光氰化物染料在蛋白质赖氨酸氨基上显色不同，对样本蛋白质进行标记，被标记的蛋白等电点和相对分子量基本不受影响。等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同的荧光强度来体现。与传统双向电泳方法相比，2D-DIGE具有高效性、检测动态范围广、定量精确、灵敏度高、重复性好等优点。Egan等[8]指出，在研究骨骼肌线粒体蛋白质组表达的差异时，2-DE方法仅能使肌肉样品中很少的线粒体蛋白溶解。另外，由于2-DE敏感性较低，线粒体蛋白无法准确定位。作者利用2D-DIGE结合液相色谱—串联质谱法（LC-MS/MS）分析8名受试者运动前后股外侧肌内线粒体蛋白质组表达的差异，结果显示有31个蛋白点出现表达差异。

1.2 基于非凝胶的蛋白质技术

近些年来，基于非凝胶的蛋白质分离技术因其高效、快速、高灵敏度、高自动化程度等优点被用于骨骼肌蛋白组学分析[9，16-19]。其中，多维液相色谱法（Multi⁃dimensional liquid chromategraphy methods，MDLC）因其良好的分辨率和更高的峰容量而备受关注，在蛋白质样品分离分析中得到广泛的应用[20]。特别是高效液相色谱与串联质谱连用，可以减小样品损耗，且较低的蛋白含量也可被分析出来[21]。Ichibangase等[18]利用荧光衍生化-高效液相色谱-串联质谱法（Fluoro⁃genicderivatization-high performance liquid chroma⁃tographytandem mass spectrometry，FD-HPLC-MS/MS）应用于纯血马运动前后骨骼肌蛋白表达谱的分析，结果显示有16种与能量代谢特别是无氧代谢相关的蛋白质出现差异表达。Schild等[19]报道高效液相色谱—电喷雾串联质谱法（High performance liquid chroma⁃tography-electrospray ionization-tandem massspec⁃trometry，HPLC-ESI-MS/MS）用于分析未经急性耐力运动和经急性耐力运动的人群的骨骼肌蛋白质组，结果显示有92种蛋白质出现差异表达。在急性运动组中，肌肉纤维特定蛋白和氧化磷酸化、三羧酸循环相关蛋白均显著增加。

1.3 联合凝胶和非凝胶技术的蛋白组学分析

在一些蛋白组学研究中，有研究者联合凝胶和非凝胶的蛋白质分离技术用于蛋白多维分离。通过凝胶电泳技术分离蛋白质，然后切取凝胶胶带或胶点，用蛋白酶消化并作液相色谱-电喷雾串联质谱分析（LCESI-MS/MS）。Hussey等[22]报道利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）联合HPLC-ESI-MS/MS鉴定出糖尿病2型受试者股外侧肌中共1329种蛋白，其中70种蛋白质受运动的调节。这种方法可以检测到低丰度蛋白和膜蛋白，但是在蛋白质定量检测及差异表达分析方面仍存在挑战。

2 运动对骨骼肌蛋白组学的影响

2.1 特定运动对骨骼肌生物学过程的影响

骨骼肌可对运动的不同类型（抗阻力运动、耐力运动），不同强度（低、中、高）和持续时间（急性、慢性）做出不同的蛋白水平的应答。通过蛋白组学技术可以进一步发现其调节规律。

一般来说，运动可分为耐力运动和抗阻力运动，代表两种能量消耗的形式，即有氧运动和无氧运动。虽然耐力和抗阻力运动均有利于身体健康，但骨骼肌的适应性改变与这两种特定的运动模式高度相关[23，24]。抗阻力运动和耐力运动会引起不同类型的收缩刺激，促使不同的通路进行调控和蛋白应答的发生[24，25]。具体而言，耐力运动可促进线粒体生物合成和骨骼肌纤维由快肌纤维向慢肌纤维转变，这可能与AMPK-PGC-1α信号通路的激活有关；抗阻力运动对骨骼肌纤维类型影响较小，会因蛋白质大量合成而使肌肉肥大，这可能与PKB-TSC2-mTOR信号通路有关[26]。Atherton等[26]将此结果归纳为“AMPK-PKB转换”（AMPK-PKB switch）。

关于运动持续时间对骨骼肌蛋白质组影响的研究显示，相对于急性运动而言，慢性运动产生变化的蛋白质数量更多[27]。据Padrao等[11]报道，有49种蛋白质在急性和慢性运动中常规受到调节，其中大部分蛋白质属于细胞呼吸和线粒体转运等生物过程中的功能蛋白。急性运动促进细胞氨基酸代谢过程、钙离子跨膜转运体活动、钙离子释放入细胞质和肌原纤维组装，而慢性运动诱发代谢前体物和能量的生成，三羧酸循环、肌肉收缩调节等过程的增强。研究显示，相较于慢性运动，骨骼肌纤维在急性运动后对氨基酸的需求量更大。这种新陈代谢的变化可能有助于急性运动恢复期蛋白质的合成和肌原纤维组装[28]。在肌原纤维组装过程中，支架蛋白如伴肌动蛋白相关锚定蛋白（N-RAP）、Kelch相关蛋白1（Krp1）以及伴侣蛋白如热休克蛋白90（Hsp90）、结构型热休克蛋白70（Hsc70）及UNC-45蛋白对肌纤维生成起着重要的调节作用[29]。

通常根据最大摄氧量的区别，可将耐力运动强度分为低、中、高强度运动（最大摄氧量分别＜60%，60%～80%和＞80%）。目前仅发现β-烯醇酶在任何运动强度下均有变化[30-32]。成年人β-烯醇酶在快缩肌纤维中积聚最多，其中ββ亚型占所有烯醇酶含量的90%以上，对生理刺激十分敏感[33]。ββ亚型具有较高的亲和力，易与糖酵解途径相关的酶或肌钙蛋白结合，作用于能量代谢，为肌肉收缩提供必需的能量[34]。运动主要影响骨骼肌吡啶核苷酸代谢NAD+，NADH的水平，以及线粒体ATP的生成[35]。高强度运动主要影响吡啶核苷酸代谢，中强度运动主要影响代谢前体产物、酮代谢、三羧酸循环和肌丝滑动，而低强度运动主要影响糖酵解途径中的β-烯醇酶。

2.2 肌纤维类型对运动引发的蛋白质组重构的影响

肌纤维类型对运动相关的蛋白质组的重塑也有影响[36]。根据肌纤维的收缩速度和代谢特征，可将其分为快缩-糖酵解型、慢缩-氧化型[37]。两种纤维在糖酵解、游离脂肪酸代谢、柠檬酸循环和氧化磷酸化等代谢过程相关的蛋白表达均存在差异[38]。而运动可引起两种肌纤维类型中的ATP合成酶亚基5B、线粒体肌酸激酶、肌红蛋白、葡萄糖磷酸变位酶-1和WD1重复蛋白等6种蛋白质均受到调节[11]。Magherini等[32]比较快缩-糖酵解型（胫骨前肌）和慢缩-氧化型（比目鱼肌）在有氧运动前后蛋白表达的差异，结果显示，胫骨前肌中有α-烯醇酶、β-烯醇酶、乳酰谷胱甘肽裂解酶、肌酸激酶M型、磷酸丙糖异构酶和ES1蛋白同系物6种蛋白质存在差异表达，其中糖酵解相关的酶（α-烯醇酶、β-烯醇酶和磷酸丙糖异构酶）均出现下调，表明胫骨前肌作为快缩-糖酵解型肌肉，在有氧运动过程中其代谢途径可能部分向有氧代谢转换；而比目鱼肌中仅有线粒体NADH脱氢酶1α子复体2和延伸因子Tu两种蛋白存在差异表达，均出现下调。Roca-Rivada等[10]比较快缩-糖酵解型（腓肠肌）和慢缩-氧化型（比目鱼肌）肌肉分泌蛋白组学，发现19种蛋白质出现差异表达，且经耐力运动后在腓肠肌和比目鱼肌中分别产生了10种和17种独特的分泌蛋白。其中，DJ-1蛋白在腓肠肌中更为丰富，而脂肪酸结合蛋白-3（FABP-3）则在比目鱼肌中含量更高。作者认为DJ-1蛋白与肌肉收缩后的氧化应激有关，而FABP-3与脂质代谢有关。

综上所述，通过蛋白组学相关技术可对骨骼肌蛋白质组做一整体而深入的研究。运动可引起骨骼肌的适应性应答，蛋白质组会发生相应的调整。不同运动的类型、强度和持续时间以及肌纤维类型可引起骨骼肌蛋白质组的不同变化。目前关于运动对骨骼肌重塑蛋白组学研究正在开展，但仍存在一定的技术难点。随着现有技术的不断完善和更多新技术的产生，蛋白组学研究会为阐明运动对骨骼肌重塑及其改善健康的机制研究等做出更大的贡献。

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2016.08.04

第1作者：蔡江瑜，Email：caijiangyu1@126.com；

陈世益，Email:cshiyi@163.com