几种常见细胞衰老检测指标的比较

张译元，肖芳

（中南大学湘雅公共卫生学院卫生毒理学系，湖南长沙410078）

几种常见细胞衰老检测指标的比较

张译元，肖芳

（中南大学湘雅公共卫生学院卫生毒理学系，湖南长沙410078）

细胞衰老是一种不可逆的生长停滞现象，可由各种不同的细胞应激触发。目前，在细胞衰老研究中涉及的检测指标包括衰老相关的β-半乳糖苷酶、端粒和端粒酶、衰老相关的异染色质灶、衰老相关的分泌表型、活性氧簇以及肿瘤抑制基因p53和p16等。这些检测指标在衰老研究中被广泛应用，各具特点，同时优缺点并存。本文综述几种常见的细胞衰老检测指标，并对其准确性、可信性、特异性和适用范围等方面进行比较。

细胞衰老；检测；指标

细胞衰老是一种不可逆的生长停滞现象，可由各种不同的细胞应激触发，包括DNA损伤、癌基因激活、氧化应激和外源性毒物暴露等［1］。事实上，衰老并不等同于死亡，衰老的细胞在相当一段时间内仍保持一定的代谢活性。除了细胞周期阻滞，衰老细胞还经历形态、生化和生理功能上的改变，如放大扁平的细胞形态、褐脂素的积累、DNA损伤的出现、多种基因表达的改变、促炎症细胞因子和其他因子的分泌等［2-3］。关于衰老机制的研究存在诸多理论及假说，如遗传学说、损伤累积学说、端粒学说和内分泌免疫调节学说等。首先，遗传学说认为，增殖基因表达下调及生长抑制基因表达上调导致衰老的发生。研究发现，细胞在p53，p 21，Rb和p16等衰老相关基因作用下发生老化，衰老细胞因分裂增殖停滞而不可能发生恶性转化，暗示衰老实际上是一种机体自我防御的保护性肿瘤逃逸机制［4］。其次，损伤累积学说认为，衰老是在内外环境的共同作用下，修复能力下降导致细胞不断累积错误。1956年Harman［5］首次提出，由于机体不断产生自由基，损伤细胞膜，增加DNA突变，造成功能蛋白无法正常合成，从而导致衰老。在线粒体中有1%～4%的氧转换为氧自由基，即活性氧簇（reactiveoxygen species，ROS）。线粒体DNA（mitochon⁃drialDNA，mtDNA）在线粒体基质中缺乏保护而发生突变引起呼吸链受损，进一步引起ROS堆积，恶性循环导致衰老［6］。此外，衰老的端粒学说认为，端粒DNA序列会随着细胞每次分裂逐渐丢失，最终造成细胞的衰老及死亡。尽管对衰老这一复杂过程的阐述已存在上述诸多理论和假说，但仍未形成一致的观点。目前在细胞衰老研究中涉及的检测指标包括：衰老相关的β-半乳糖苷酶（β-galactosi⁃dase，β-gal）、端粒和端粒酶、衰老相关的异染色质灶（senescence-associated heterochromatin foci，SAHF）、衰老相关的分泌表型（senescence-asso⁃ciated secretory phenotype，SASP）、P53及P16通路等。这些检测指标被广泛应用，各具特点，同时优缺点并存。鉴于衰老与肿瘤的关系，外源性化学物导致衰老的发生发展及其分子机制的研究目前仍是毒理学的热点，故本文比较几种常见细胞衰老检测指标，以期为毒理学及其他领域衰老研究中检测指标的选择以及衰老分子机制的阐明提供线索。

1 衰老相关的β-半乳糖苷酶

β-gal是应用最早且最广泛的一种源于溶酶体的衰老标志物［7］，能够在衰老细胞中增加溶酶体生物合成，被认为是细胞衰老特异性的标志物以及衰老检测的金标准［8］。Dimri等［9］收集不同年龄志愿者的皮肤样本后提取细胞进行培养，在培养的真皮成纤维细胞和表皮角质细胞中检测到，β-gal（pH=6）含量随年龄增加而增加，首次证明这种标志物在体内随着细胞老化而逐渐积累增多。此外，Pati等［10］通过改变pH和孵育时间等实验条件对老年犬的皮肤样本进行常规的β-gal染色，发现其毛囊细胞和皮脂腺细胞中β-gal的活性增加；同时也发现延长孵育时间可明显增加染色强度，提示即使是正常细胞在长时间染色条件下也有可能被染色。然而其他研究显示，在某些实验条件下非衰老细胞也表现出β-gal活性的增加［11］。Cristofalo［12］和Lee等［8］同样证实了细胞在长期或高密度培养条件下也可检测到β-gal的活性。此外，Severino等［13］比较不同年龄不同文化捐献者的组织切片、培养细胞和病毒永生化细胞，确认低密度培养H2O2诱导的衰老细胞中β-gal的活性明显增加，但检测衰老者体内分离出来的原代皮肤细胞时β-gal未发现任何变化。因此，将β-gal作为衰老生物标志物进行检测时，考虑到染色时间长短以及细胞培养密度大小等因素的干扰，应对染色条件进行严格控制，以获得准确的结果。

2 端粒和端粒酶

端粒是一种染色体末端的核蛋白复合物，其对于染色体的保护和基因组的稳定有着十分重要的意义。由于末端复制问题，端粒在每个细胞周期S期时都会缩短，当其缩短到临界长度时，就会导致细胞周期阻滞、细胞衰老及细胞凋亡［14］。Bernadotte等［15］注意到，当外界因素造成DNA双链损伤时也可发生端粒变短。端粒酶是一种能通过新添加TTAGGG重复染色体，补偿这种端粒损耗的细胞酶，在早期胚胎细胞中大量表达。尽管端粒酶在成人干细胞中也有表达，但其在成人组织中的表达不足以阻止由于端粒缩短所引起的机体老化［16］。Donate等［17］应用端粒酶基因突变小鼠观察端粒酶和端粒长度对干细胞的影响，证实端粒酶的确具有抗衰老活性。他们条件性地敲除结合蛋白端粒重复序列结合因子1（telomere repeat binding factor 1，TRF1）、三肽基肽酶1（tripeptidylpeptidase 1，TPP1）和抑制/激活蛋白1（repressor/activator protein 1，Rap1）构建端粒酶功能障碍的小鼠模型，发现即使端粒处于正常的长度也足以产生组织早衰、染色体畸变和肿瘤性病变。然而与生殖细胞、干细胞和癌细胞不同的是，大部分正常体细胞的端粒酶水平无法达到最低检出阈值。因此需要注意的是，端粒酶检测作为一种有效的判断细胞衰老的方法，仅适用于对生殖细胞、干细胞和癌细胞的研究，而在正常体细胞的衰老研究中，不宜选其作为衰老标志物。

3 衰老相关的异染色质灶

Narita等［18］在2003年首次提到SAHF。SAHF是一种富含异染色质蛋白1γ（heterochromatin protein 1γ，HP1γ）、抗沉默功能蛋白1（antisilencing function 1，ASF1）、组蛋白H3赖氨酸9三甲基化（H3 lysine9 trimethylation，H3K9me3）和磷酸化组蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）的染色质修饰，能够隔离细胞周期调控基因，加强与衰老相关的生长停滞［19］。有研究显示，在衰老细胞中异染色质的丢失导致基因不稳定性增加，从而引起DNA双链断裂修复能力的下降［20］。Collado等［21］报道，SAHF可通过抑制与增殖相关的部分基因蛋白的表达，诱导细胞衰老，并维持稳定的衰老状态。Kreiling等［22］在培养的老年人成纤维细胞中发现，异染色质相关的巨组蛋白H2A（macroH2A）和异染色质蛋白1β（heterochro⁃matin protein 1β）的水平明显增加。然而Kennedy等［23］检测并比较了衰老的人胚肺成纤维细胞IMR90和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）中的SAHF，发现相对于IMR90，MEF无法形成SAHF以响应癌基因Ras的激活以及端粒酶的缩短，即无法使用SAHF标记MEF的衰老现象。尽管检测某些细胞或组织的SAHF能证实衰老的发生，但并非在所有种属的衰老细胞中都可检测到SAHF，所以SAHF作为一种衰老标志物具有局限性，在研究中不能作为判断是否发生衰老的唯一检测手段，需要结合其他衰老相关的检测方法综合判断。

4 衰老相关的分泌表型

衰老细胞能够通过自分泌和旁分泌向细胞外环境分泌不同的分子，包括细胞因子、生长因子、趋化因子和基质金属蛋白酶等，即SASP［23］。SASP可改变细胞的微环境，其作用一方面可激活机体的免疫系统清除衰老细胞，另一方面可促进邻近的受体细胞发生恶性转化［24-25］。不同种类的衰老细胞分泌的SASP虽然在成分上不尽相同，但都特异性地表达高水平的细胞炎症因子白细胞介素6（interleu⁃kin 6，IL-6）和IL-8。Kuilman等［26］通过结合分析遗传学和生物信息学，并利用人二倍体成纤维细胞体外模型，发现癌基因诱导的细胞衰老与某些炎症转录因子的激活有关，并证实转录因子CCAAT增强子结合蛋白β能联合IL-6增强IL-8的激活，而导致衰老。目前研究报道，IL-6与DNA损伤导致的小鼠和人角质形成细胞、黑素细胞、单核细胞、成纤维细胞和上皮细胞的衰老均有关联［27-28］。由于细胞因子IL-6和IL-8等也同时参与包括炎症反应在内的多种生理病理过程，所以SASP虽不能作为判断衰老发生与否的特异性指标，但在实际研究中可通过结合其他检测指标来共同判断衰老的发生情况，特别是在研究衰老对细胞或组织微环境的改变时，研究SASP具有重要的生物学意义。

5 活性氧簇

现已研究表明，细胞衰老伴随ROS水平增高，且ROS作为衰老的诱发机制已被广泛研究。细胞在某些因素（如癌基因活化、应激反应和外来化学物暴露）的诱导下可产生高水平的ROS，导致无法修复的双链DNA断裂（double-strand DNA breaks，DSB），而这种DNA损伤的积聚正是衰老细胞的共同特征［29-30］。Maciel-Barón等［31］报道，氧化应激能够诱导小鼠肺成纤维细胞早衰。研究发现，用刺桐酚素处理胰腺癌和乳腺癌细胞能够促进其内质网生成大量ROS，最终使细胞周期发生G1期阻滞而触发衰老［32］。Luo等［33］用白藜芦醇（resveratrol，RV）诱导肺癌细胞衰老，发现RV能通过上调NADPH氧化酶-5（NADPH oxidase 5，Nox5）的表达引起DSB与ROS水平的增加。Martinez等［34］发现，人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncy⁃tialvirus，HRSV）能够诱导DNA损伤标志物的表达，并继发靶细胞线粒体ROS的生成，导致DNA损伤的积累，最终触发靶细胞早衰。虽然在所有的衰老细胞中几乎都伴随ROS的大量堆积，但ROS参与调节细胞内多种信号转导途径及病理生理过程，故ROS水平增高不能作为细胞衰老发生的标志性事件。ROS作为衰老检测指标的研究意义主要在于其高度的敏感性。已有研究表明，在衰老诱发因素作用后仅数分钟内，细胞中ROS水平便达到高值，进而触发其下游一系列的分子事件。故ROS的检测对衰老相关分子机制的阐明具有重要的意义。

6 肿瘤抑制基因和蛋白

研究表明，衰老的发生与肿瘤抑制基因和蛋白P53/P21有关［35］。P21是细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂家族中的重要成员，能够抑制CDK2而引起G1期细胞周期阻滞。Chakraborty等［36］用刺桐酚素诱导胰腺癌细胞和乳腺癌细胞后发现，大部分细胞SA-β-gal活性增加，以及形成SAHF，随着细胞扁平程度和粒度的增加（衰老的特征表型），P21水平也随之上升；同时CDK2和细胞周期蛋白D1（cyclinD1）含量明显下降；N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）抑制ROS的形成，降低P21的表达。表明刺桐酚素暴露可通过增加体内ROS水平，激活P21，触发G1期细胞周期阻滞，诱导衰老的发生。Johmura等［37］应用延时活细胞成像系统分析多种刺激诱导的人成纤维细胞的衰老过程，发现其在进入永久性细胞周期阻滞前发生有丝分裂“跳过”（mitosis skip），由P53依赖性的后期促进复合物/细胞周期体（ana⁃phase-promoting complex/cyclosome）的激活诱导。然而，在用电离辐射诱导人乳腺癌细胞MCF-7后进行蛋白质组学分析发现，P53/P21可能并不是一种特异的衰老标志物，因为在细胞凋亡及短暂细胞周期阻滞过程中，其蛋白水平也会发生改变，而由衰老诱导的P53/P21蛋白水平增加又是细胞凋亡程序失活的一种补偿，所以检测到P53/P21水平增加并不能区分其具体诱导原因是衰老还是凋亡。虽然在衰老研究中尚不能将P53/P21作为特异性标志物，需结合其他检测指标综合判断衰老的发生情况，但P53/P21及其下游基因构成一条重要的衰老通路，对其深入研究有助于对衰老机制的探讨。

P16作为一种应用较为广泛的衰老标志物，是一种CDK抑制因子。P16能够阻止成视网膜细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein）的磷酸化及失活，形成E2F复合体，从而调节细胞周期进程相关基因的表达。通过检测衰老细胞中P16的表达表明，与静止的或终末分化的细胞不同，大部分衰老细胞（如人成纤维细胞、外周血T淋巴细胞和小鼠体细胞等）都能够表达P16，且其表达水平随衰老程度的增加而明显增加［38］。有学者在研究衰老小鼠模型时发现，在脂肪、骨骼肌和眼等组织中，P16有助于衰老表型的形成，而敲除p16基因后小鼠发生了衰老延迟［39］。Burd等［40］将p16基因敲入小鼠体内对其进行终身荧光评估（lifelong assessment of lumi⁃nescence）发现，所得指数随鼠龄的增加而增加，提示P16的表达可能是人类和小鼠组织中较为可信的体内衰老标志物。

7 展望

随着我国人口老龄化高峰的到来，有关衰老机制及衰老相关标志物的研究，对于老年病的防治和抗衰老药物的研究具有重要的科研和现实意义。研究发现，环境污染物及某些外源性毒物的暴露可使人体的衰老提前发生。在外源性化学物致机体衰老的研究中，选择适当的检测指标，明确每种指标的应用条件以及各自的优势和劣势，有利于对衰老分子机制的阐明，从而为进一步的科学研究提供重要的线索和研究方向。

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Comparison of severalcommon detection indexes of cellsenescence

ZHANG Yi-yuan,XIAO Fang
(Department of Health Toxicology,Xiangya Schoolof Public Health,CentralSouth University, Changsha 410078,China)

Cell senescence is a state of irreversible growth arrest,which can be triggered by a variety of different cellular stress.Currently,the detection indexes involved in the study of cellsenes⁃cence include senescence-associatedβ-galactosidase,telomeres and telomerase,senescence-associ⁃ated heterochromatin foci,senescence-associated secretory phenotype,reactive oxygen species,and tumor suppressor genes p53 and p16.These indexes are widely used in the study of cellsenescence, each with its own characteristics or advantages.This review summarizes several common cellsenes⁃cence indexes and compares theiraccuracy,credibility,specificity,and potentialapplications.

cellsenescence;detection;index

XIAO Fang,Tel:(0731)84805461,E-mail:fangxiao@csu.edu.cn

R965.1

：A

：1000-3002-（2017）04-0352-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.009

Foundation item:The project supported by NationalNatural Science Foundation of China(81302456);and Natural Science Foundation of Hunan Province(2015JJ3135)

2016-11-11接受日期：2017-04-07）

（本文编辑：赵楠）

国家自然科学基金（81302456）；湖南省自然科学基金（2015JJ3135）

张译元，女，硕士研究生，主要从事肝脏分子毒理学研究。

肖芳，E-mail：fangxiao@csu.edu.cn，Tel：（0731）84805461