类器官在结直肠癌研究中的应用进展*

王文东 周 鑫 综述 付 卫 审校

(北京大学第三医院普外科,北京 100191)

·文献综述·

类器官在结直肠癌研究中的应用进展*

王文东 周 鑫 综述 付 卫**审校

(北京大学第三医院普外科,北京 100191)

肿瘤局部进展和转移是结直肠癌的主要死因，以个体化精准医疗为基础的多学科联合治疗是进展期结直肠癌的主流治疗模式[1]。随着肿瘤分子生物学机制研究的深入，多个肿瘤演进过程中的关键基因突变被发现，并逐渐成为个体化治疗模式中的药物靶点[2]。Guinney等[3]在大规模测序基础上提出的结直肠癌分子分型对结直肠癌的个体化治疗产生了巨大而深远的影响，让我们可以针对不同的分型采取相应的治疗措施。尽管如此，以遗传学为基础的肿瘤生物学行为研究却仍停留在传统的肿瘤细胞系和动物成瘤模型层面，成为阻碍日益完善的高通量组学研究应用于临床的绊脚石。

近年来，随着对干细胞研究的深入，类器官(organoids)培养技术逐渐兴起。类器官来源于干细胞，经过体外3D(three-dimensional)培养后含有多种细胞类型，并能以与体内相似的方式经增殖和分化实现自我组建，形成类似体内正常器官上皮腺体的结构[4]。类器官主要在上皮结构丰富的器官中培养成功，如胃[5]、小肠[6]、结直肠[7]、胰腺[8]和前列腺[9]等。肿瘤类器官可用来研究肿瘤的演变过程，评估药物的疗效和毒性[10]，探究肿瘤干细胞的作用以及肿瘤的转移机制[11]，更准确地研究肿瘤细胞的生物学特性。本文主要综述类器官在结直肠癌研究中的应用进展。

1 肠道类器官起源

1.1 肠道上皮干细胞

肠道黏膜层由肠绒毛覆盖，绒毛的基底部有称为隐窝(crypts)的龛状结构，这里有负责肠上皮持续更新的干细胞。肠黏膜上皮干细胞定居在隐窝的底部，通过快速分裂产生过渡(transit-amplifying，TA)细胞，逐渐占据隐窝上部，进而生长到绒毛的两侧，接着进行细胞分化，生成其他类型的肠细胞，其中包括具有吸收功能的肠绒毛细胞，以及具有分泌功能的细胞，如潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和M细胞。2007年，荷兰Barker等[12]发现肠道干细胞具有富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5)标记，Lgr5位于干细胞表面，由Wnt靶基因编码，是Wnt信号激动剂R-spondins的受体。在隐窝底部，Lgr5+干细胞和潘氏细胞交错排列，潘氏细胞表面表达Notch配体Dll1和Dll4，可以使干细胞维持在未分化状态，如果Notch信号关闭，干细胞就会分化而失去干细胞特性。潘氏细胞可以分泌表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和Wnt激动剂(Wnt3)，这些因素有利于干细胞的生存[13]。

1.2 类器官的体外培养

2009年，荷兰Sato等[6]利用小鼠肠道上皮隐窝底部Lgr5+柱状细胞，在基质胶(Matrigel)中培养出类器官；2011年Jung等[14]用此方法将人结直肠黏膜中EphB2高表达的细胞培养成结直肠类器官，同年Sato等[7]培养人结直肠肿瘤类器官。肠上皮中的干细胞，经过流式细胞术富集后加入基质胶中培养，可在1～2天后长出透亮球形结构，随后进行分化出芽，形成类器官结构。类器官传代后仍保存稳定的遗传特性和生物学行为，并且可以冻存和复苏[15]。类器官主要在基质胶中生长，培养液主要成分有Wnt通路激活剂、EGF、骨形成蛋白抑制剂Noggin等。培养液模拟体内干细胞所处的微环境，其中Wnt信号通路激活剂R-spondin-1和EGF是Lgr5+干细胞进行增殖的重要因素；Noggin可以使类器官中隐窝数目增多；富含层粘连蛋白的Matrigel提供支持类器官生长的环境[16]。在人肠道类器官培养中添加一些小分子物质，如胃泌素(gastrin)和尼克酰胺(nicotinamide)，可以延长类器官的存活时间；小分子抑制剂A83-01(Alk4/5/7的抑制剂)、SB202190(p38抑制剂)可以有效提高类器官形成率[7]。肠道类器官经过传代培养，可存活6个月以上，并且细胞的基因型和表型不会发生改变[15]。同时，人类结直肠肿瘤细胞中存在的基因突变使其能在不含R-spondin-1、Noggin和EGF的培养基中形成类器官，原因是这些突变能异常激活自身信号通路来促进类器官生长[17]。

2 类器官成为结直肠癌研究的重要工具

肿瘤细胞系和动物模型通常作为结直肠癌研究的重要手段。肿瘤细胞系在培养过程中会出现很多额外的突变，不能忠实地表现出肿瘤原有特性；也不能模拟体内肿瘤细胞和其他基质细胞之间的相互作用；培养细胞单一，缺乏不同细胞类型的层次性。动物模型有很广泛的应用，但不能完全反映出人类肿瘤的基因特征和异质性；也不能用于研究肿瘤的发生过程；并且肿瘤异种移植费时费力，培养周期长，效率不高，且很难进行高通量药物筛选工作[18]。而类器官培养能保持肿瘤原有的基因型和生物学特性，可以稳定传代，操作相对简单，培养周期短，van de Wetering等[19]从20名结直肠癌患者的肿瘤中取材得到20处正常黏膜和27处肿瘤样本，经过培养得到19个正常类器官和22个肿瘤类器官，成功率超过90%，而且培养过程中存在肿瘤干细胞增殖并分化为肿瘤细胞的过程，符合肿瘤研究更深层次的要求。同样，最近研究揭示结直肠癌发生过程中遗传学的改变：持续的基因突变，基因拷贝数改变，染色体改变，甲基化改变[20]，类器官培养技术在研究肿瘤干细胞分化为不同类型肿瘤细胞的过程、揭示影响肿瘤异质性、演化和转移的原因、评价药物疗效方面提供了很大帮助。

2.1 肿瘤类器官基因编辑和肿瘤动物模型建立

Roper等[21]利用动物肠镜将CRISPR-Cas9基因编辑后具有APC、P53和Kras突变的小鼠结肠类器官注射到小鼠肠黏膜下，建立大肠黏膜原位移植模型，6周后该模型中10只小鼠共长出15个肿瘤，12周后3只出现肿瘤肝转移，之后又将人结直肠癌类器官注射到小鼠肠黏膜下，26只小鼠中有8只发生肝转移，并且得到的肿瘤高度保持原发肿瘤的形态和分化特征，而肿瘤细胞系注射后虽然也能成瘤，但形成的肿瘤缺乏转移性，无法反映原发肿瘤的组织学特征；与之相似，O’Rourke等[22]在诱导小鼠肠炎形成利于肿瘤定植的微环境后，将基因编辑后的类器官悬液通过灌肠的方式注入小鼠肠管内，成功建立原位成瘤模型，该模型在4～9周内成瘤，21周时有肝转移出现。基于基因编辑技术的类器官原位移植动物模型的出现，在保持原发肿瘤组织学特征和肿瘤微环境的同时，大大节省了建立模型所需要的时间，势必会成为今后肿瘤体内研究的主流模型。

2.2 研究结直肠癌的演进和药物筛选

Schütte等[23]研究以EGF受体(EGFR)为靶点的结直肠癌治疗药物的敏感性和生物分子标记物之间的相关性，对比19对结直肠癌类器官模型与传统的体外成瘤模型，观察到其中有9对模型对阿法替尼的敏感性一致，12对模型对Sapitinib敏感性一致，这为类器官模型在药物筛选中的应用提供了依据。Fumagalli等[24]利用CRISPR/Cas9技术对人结肠类器官进行基因编辑，得到APC、KRAS、SMAD4和P53中三者突变组合或者4种基因都突变的类器官，随后将这些类器官移植到小鼠盲肠壁上，观察到4种基因都突变的类器官使9只小鼠中的4只小鼠发生肝转移，共有81个病灶。SMAD4野生型的组合中，7只小鼠中只有1只肝脏上出现1个转移灶，而剩下3种组合中都没有发现肝转移，这为研究肿瘤进展提供了新方法。Pauli等[25]根据Ⅳ期结肠癌病人肿瘤全基因组测序得到的基因突变数据，结合类器官培养技术选择相应靶向药物，探讨药物联合应用的有效性，结果显示在含有APC突变病人的肿瘤类器官移植小鼠中，阿法替尼和伏立诺他(Vorinostat)组合明显抑制肿瘤生长，肿瘤大小仅为FOLFOX化疗方案处理后的10%(P=0.0232)。van de Wetering等[19]成功构建具有22例结肠癌类器官的样本库，结合药物敏感性实验，观察到O-酰基转移酶Porcupine的一种小分子抑制剂IWP-2对含有RNF43(ring finger protein 43)突变的类器官生长有很强的抑制作用,而没有RNF43突变的类器官生长却不受其影响，这为结肠癌的治疗提供了新的靶点。

2.3 研究结直肠肿瘤干细胞

Cortina等[26]用CRISPR/Cas9基因编辑技术将绿色荧光蛋白标签标记到Lgr5基因上，结合细胞谱系示踪技术，研究结肠癌类器官中肿瘤干细胞的演变。他们将结肠癌类器官移植到小鼠体内，2周后观察到Lgr5+干细胞在小鼠体内分化成具有黏液分泌和吸收功能的细胞，数量是移植前的3倍，类器官中还有部分Lgr5+干细胞位于休眠状态，可能提示肿瘤中Lgr5+干细胞的分化受到微环境的调控。此方法可用来进一步研究肿瘤中Lgr5+干细胞的功能，探索不同类型细胞在肿瘤生长、转移、耐药性中的作用。de Sousa e Melo等[27]利用结直肠癌类器官进行小鼠成瘤后，用药物杀伤肿瘤中的Lgr5+干细胞，观察到肿瘤生长虽然停滞但是不能消退，停药1周后肿瘤中Lgr5+干细胞从0迅速恢复到20%，肿瘤继续生长，可能存在某种机制可以使Lgr5-大量增殖并在停药后转变为Lgr5+干细胞；利用肿瘤类器官培养技术，寻找阻止肿瘤干细胞Lgr5可塑性转化的方法，有利于肿瘤的根治。

2.4 研究结直肠癌发生转移的机制

Weeber等[28]利用穿刺活检得到8例结直肠癌肝转移患者的转移癌组织，一部分直接进行DNA测序，另一部分培养成类器官后测序，观察到两者90%的体细胞突变相同，肿瘤驱动基因突变完全一致，DNA拷贝数平均相关性达到0.89，说明结直肠癌肝转移类器官很好地保持了肝转移病灶的遗传学特征，为肿瘤的个体化治疗提供了有力依据。Fujii等[17]利用结直肠腺瘤和息肉、不同肿瘤分期的结直肠腺癌、神经内分泌癌和转移癌构建出共55种类器官模型，观察到这些类器官模型表现出与来源组织相同的组织学分型和分化程度。随后研究者比较不同类器官对培养基中小生境因子(niche factor)的依赖性，观察到结直肠腺癌分期增加，类器官对小生境因子依赖性逐渐降低，其中1例肝转移癌类器官及其原发癌类器官几乎不依赖小生境因子，其余4例只依赖EGF和P38抑制剂，推测结直肠癌类器官的侵袭和转移行为可能与小生境因子无关，而与肿瘤转移的驱动基因激活有关。Usui等[29]观察到结直肠癌类器官含有分泌TGF-β的成纤维母细胞，TGF-β可以促进结直肠癌细胞生长和远处转移[30]，并且可以使成纤维母细胞分化为成纤维细胞，促进结直肠癌的转移。

2.5 其他肿瘤类器官模型为结直肠癌的治疗提供参考

目前已有多个实验室成功构建出胰腺癌类器官模型[31]。Huang等[32]用甲基转移酶EZH2的抑制剂UNC1999处理5例病人的胰腺癌类器官，观察到含有甲基转移酶EZH2作用位点的3例胰腺癌类器官生长受到抑制；使用UNC1999联合吉西他滨处理后，又有1例类器官的生长受到抑制，这种针对肿瘤表观遗传学的治疗方法，为结直肠癌治疗提供了新思路。前列腺肿瘤类器官模型不仅来源于前列腺癌穿刺活检组织，也可由血液中循环肿瘤细胞培养获得，在更深层面上促进了“液体活检”的临床应用[33]。

3 展望

类器官虽然具有广阔的应用前景，但是缺乏间叶细胞支持、神经支配和血管支持，因此类器官与真正的器官之间还有很大距离。新的类器官培养模式的出现允许上皮类器官和间质细胞共同培养，可以进一步利用类器官研究肿瘤与间质组织细胞的相互作用[34]，而肿瘤类器官与神经、血管组织共培养研究的进展也正在弥合类器官培养的这一差距；随着基因编辑技术的发展，我们可以更加灵活和准确地在基因层面操作类器官，使通过生物学行为验证的基因组学“批量”研究成为可能；类器官作为研究结直肠癌的模型，结合多层面多组学研究技术，可以全面揭示肿瘤发生发展过程中不同组学信息的变化，深入理解肿瘤的发生过程，并发现肿瘤发生发展的驱动因素，探索新的治疗模式；类器官培养技术可以用来高通量筛选抗肿瘤药物，同时类器官培养能保持肿瘤原有的基因型和生物学特性，这使以病人为中心的超精准个体化治疗成为现实。

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A

1009-6604(2017)12-1126-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.12.020

国家自然科学基金(项目编号：81672361)

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2017-07-03)

2017-09-27)

王惠群)