旋毛虫病诊断方法研究综述

（中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，世界卫生组织热带病合作中心，科技部国家级热带病国际联合研究中心，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，上海 200025）

旋毛虫病诊断方法研究综述

翟铖铖，陈家旭，陈韶红，吴秀萍

（中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，世界卫生组织热带病合作中心，科技部国家级热带病国际联合研究中心，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，上海 200025）

旋毛虫病对畜牧业及人类健康造成了严重危害。本文对动物及人类旋毛虫病的诊断方法进行了综述，如病原学诊断方法（包括压片镜检法和集样消化法）、免疫学诊断方法（包括抗体检测、循环抗原检测和蛋白芯片技术）、分子生物学诊断方法（包括聚合酶链反应技术和环介导等温扩增技术）以及基因芯片技术，分析了现有研究方法的优点和不足，为后续寻找更快速、高效、便捷、准确的诊断方法提供理论参考。

旋毛虫；旋毛虫病；诊断方法

旋毛虫病是由旋毛形线虫引起的食源性人兽共患寄生虫病，呈世界性分布。该病的感染宿主可达150余种[1]，动物及人类主要通过食入含有感染性幼虫的肉类及其制品而感染该病。自1835年首次发现以来，旋毛虫经常引起突发性重大公共卫生事件，是世界各国屠宰动物首检和强制性必检的人兽共患病病种，也是目前世界范围内投入防控费用较高的食源性人兽共患寄生虫病之一。目前，加强对该病的检验与诊断，是控制该病的唯一有效途径。

旋毛虫病的诊断方法主要分为病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。动物感染旋毛虫后几乎没有任何症状，因此宰后检疫大多采用病原学诊断方法[2]。分子生物学方法是通过肌肉样本进行诊断的新兴诊断方法。而人旋毛虫病因临床表现症状不明显，临床诊断较为困难，易与其他传染病混淆，所以主要通过肌肉活检、发现幼虫或包囊来确诊，但在感染早期往往不易检出，且通过外科手术进行治疗导致的创伤较大，病人往往难以接受。因此，通过血清样本进行诊断的免疫学方法是最理想的诊断方法。然而，当前每种诊断方法都存在一定的弊端，完善旋毛虫现有检测方法以及寻找一种更合适的诊断技术，仍是众多学者的研究热点。本文对旋毛虫病的诊断方法进行了综述，为进一步完善和研制有效的旋毛虫病诊断技术提供重要的理论参考。

1 病原学诊断方法

旋毛虫病的病原学诊断方法包括压片镜检法和集样消化法。这2种方法是我国猪旋毛虫病诊断的标准方法。

1.1 压片镜检法

根据世界动物卫生组织（OIE）的诊断检测和疫苗标准手册，采集规定部位的28粒燕麦粒大小（2 mm×10 mm）肌肉组织样品，总质量约0.5 g。用2个载玻片将肌肉粒压至接近透明，在传统立体显微镜或旋毛虫检查镜下进行检查。OIE推荐方法适用于野猪、家猪和马属动物中旋毛虫肌幼虫的检测[3]，而对于人体旋毛虫病的临床确诊，一般取腓肠肌的肌肉进行压片镜检。在检验旋毛虫时，往往会发现住肉孢子虫和发育不完全的囊尾蚴，典型虫体较容易被辨认，但如果其发生钙化、死亡或溶解现象，则容易混淆，在检查时需注意鉴别。

对于压片镜检法，当肌肉中虫体密度达到3条/g时方可检出。该法对操作者的要求较高，且对早期感染、轻度感染及没有包囊的虫种不易检出，容易误诊和漏诊。我国在动物屠宰检疫中多用目检法和镜检法相结合的方法[4]，有的则采用压片镜检法和免疫胶体金检测相结合的方法[5]，需耗费大量人力与时间。

1.2 集样消化法

根据欧盟法令（77/96/EEC号令）规定的磁力搅拌器法[6]，取待检动物易感部位肌肉组织样品约100 g于烧杯中，加入含1%胃蛋白酶和1%盐酸的人工消化液，将其置于热板磁力搅拌器，46～48 ℃下均匀搅拌30 min，用网筛（180目）过滤肉渣组织，静置沉淀30 min，将10 mL下层沉淀液转移至带有网格的培养皿中，在旋毛虫检查镜或者立体显微镜（15～40×）下检测样品中是否存在旋毛虫。该法是国际旋毛虫病委员会的推荐方法，其敏感性为肉中虫体密度达到1条/g时即可被检出，大多数发达国家采用此法对屠宰动物进行检疫。但吴秀萍等[7]指出，对于不同种及基因型的旋毛虫，在不同温度和沉降时间上，回收的肌幼虫百分比存在明显差异，用现有国际标准的消化法检验旋毛虫会有一定的偏差，且在感染率低或对感染14～18 d的成囊前幼虫检查时，可能会造成漏检[8]。单个胴体检验需要耗费大量人力和时间，相比之下，集样消化法可一次检测胴体多达100余头。虽然集样消化法需要相对较多的科研技术和设备，但其更为廉价和有效，所以大多数发达国家仍采用消化法对屠宰动物进行例行检验。

2 免疫学诊断方法

免疫学方法具有快速、简便、敏感性高等优点，既解决了人体取材的局限性，又克服了临床病症易误诊的难题，并且人与动物可通用，该法逐渐成为旋毛虫病诊断方法的研究热点。目前，旋毛虫病诊断抗原主要有虫体粗抗原、表面抗原、排泄分泌（ES）抗原、杆细胞颗粒相关抗原、重组抗原和循环抗原等。然而，免疫学诊断方法所应用的抗原存在特异性和敏感性差以及存在诊断盲区等弊端，因此仅能作为临床辅助检查方法。

2.1 抗体检测

2.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA由于敏感性和特异性较高且具备早期应用诊断价值，是目前检测旋毛虫感染最常用的辅助方法之一。ELISA方法检测的一系列实验或实地研究，已被广泛应用于猪血清和肉汁样品检测，检出率高于镜检法[9]。ELISA的敏感性和特异性很大程度上取决于应用抗原的质量，也与操作程序和宿主种类有关。由于旋毛虫肌幼虫的ES抗原较好制备，所以它是旋毛虫病最常用的诊断抗原。但其对IgG 抗体敏感性较高，往往假阳性结果偏高，需用免疫印迹法来确认。由于肌幼虫的ES抗原具有阶段特异性[10]，所以IgG抗体一般可以在感染后12～60 d内被检测出来[11]，但因其对早期的IgE和IgM不敏感，所以利用单一肌幼虫期ES抗原检测旋毛虫最佳感染期应为感染45 d后[12]，因此不能用来做早期诊断。虽然肌幼虫易获得，但因必须人工制备，会导致每批质量不一，且交叉反应严重，因而无法进行标准化，其特异性和程序标准化问题也有待解决[13]。虽然ELISA方法使用广泛，其试剂盒也在市场中全面推广，但商业化的ELISA试剂盒还没有标准化，大多数不稳定，也未用健康人群和旋毛虫病确诊人群的血清样本进行验证。由于肌幼虫ES蛋白有以上诸多弊端，因此敏感性和特异性更高、稳定性更好、更容易制备、可用于早期诊断的抗原成为各国学者研究的焦点。随着基因工程的发展，重组抗原有着广阔的前景，如：旋毛虫肠道期6 h幼虫的ES蛋白[14]，旋毛虫成虫的ES抗原[15]，旋毛虫肠道期6 h幼虫的cDNA文库筛选出的半胱氨酸蛋白酶抑制剂编码基因表达出的重组Ts-CLP蛋白[16]，从肌幼虫ES蛋白中筛选出来的编码31 kDa基因而后表达出的重组31 kDa蛋白[17]，以及旋毛虫成虫ES蛋白中定位于杆状体的L20h-Ts3蛋白等[18]。

2.1.2 免疫印迹法（WB）。WB有着较高的特异性和敏感性，但其操作过程比较繁琐，通常用来确认ELISA检测的阳性血清。有研究称，采用ELISA与WB相结合的方法来检验猪旋毛虫病，其敏感性是消化法的31.4倍[19]。另外，Gómez-Morales等[20]发现，所有旋毛虫病阳性血清用WB检测后都有1个三条带模式，人血清在53～72 kDa之间，猪血清在48～72 kDa之间，这意味着WB可能会成为检测旋毛虫病的金标准。

2.1.3 环幼沉淀试验（CPT）。CPT是旋毛虫特有的血清学试验，幼虫分泌的排泄物与特异性抗体结合，在幼虫的体表特别是口及肛门部位，产生具有折光性的团块状或泡沫状沉淀物，结果易于判断，具有较高的敏感性和特异性，操作简单且无需特殊设备，适用于基层应用。朱敬等[21]同时运用斑点ELISA和CPT来检测这2种方法对旋毛虫病的特异性与敏感性，结果阳性率分别为97.5%和95%，且特异性较高，表明在临床诊断时，用这2种方法同时检测，可提高临床诊断的准确率。

2.1.4 免疫酶染色试验（IEST）。IEST的原理与ELISA基本相似。朱敬等[22]采用IEST和CPT相结合的方法检测实验感染旋毛虫的大鼠血清特异性抗体，其阳性率分别为97.6%和95.1%，说明IEST和CPT对旋毛虫特异性IgG抗体的检测均有较好的敏感性和特异性。在诊断方法的评价方面，在诊断旋毛虫病时，IEST以含有旋毛虫幼虫的肌肉组织切片为抗原，具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点，且抗原片可置于-20 ℃以下长期保存，通过光学显微镜即可观察结果，无需特殊设备。

2.1.5 胶体金免疫层析法。胶体金免疫层析法是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，因其将免疫分子亲和原理和免疫印记法、经典的薄层层析技术相结合，操作简便、快速，日益受到重视。秦银霞等[23]用胶体金标SPA和旋毛虫排泄分泌抗原的免疫层析试纸条检测，整个操作时间仅需15 min，操作简便，不需特殊仪器设备，检测结果可长期保存。李雁萍[24]利用免疫层析试纸条检测经5 000条旋毛虫感染的猪，并与镜检法做比较，结果表明试纸条有着很高的敏感性与特异性，在猪肉检疫中有很好的应用前景。

2.1.6 乳胶凝集试验。乳胶凝集试验是以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验，即吸附可溶性抗原于其表面，待特异性抗体与之结合之后，产生凝集反应。这种方法简单、省时、客观性强，但其敏感性主要取决于待检查的肉制品，通常比人工消化法的敏感性要低，且这种方法不适用于腌制的肉制品检测[25]。但伯乐公司生产的乳胶凝集试剂盒在经过欧洲5个实验室的验证之后，证明该试剂盒的敏感性较高，特异性好，重复性和稳健性也较好，可用于猪肉中的旋毛虫快速检测[26]。

2.2 循环抗原检测

宿主感染旋毛虫后，旋毛虫的排泄分泌物进入血液中形成循环抗原，因此可以利用已知的抗体来检测抗原。王中全等[27]利用IgY和单克隆抗体的夹心ELISA来检测感染旋毛虫的鼠血清中的循环抗原，结果表明，这种方法可以检测鼠血清中排泄分泌抗原的量为1 ng/mL，并且可以在500条旋毛虫感染小鼠的第3天就检测到血清中的循环抗原。这种方法的敏感性可以用作检测旋毛虫早期感染以及旋毛虫病的化学治疗评价，但在特异性上仍存在不足。

2.3 蛋白芯片技术

陈家旭等[28]曾用蛋白芯片技术及5种不同的半纯化粗抗原和人类血清来检测5种食源性蠕虫（猪囊尾蚴、广州管圆线虫、并殖吸虫、旋毛形线虫和迭宫绦虫），结果显示，此方法敏感、快速、通量高，可应用于这5种蠕虫的大规模流行病学调查，为寄生虫病的大量样品检测提供了思路。另外，旋毛虫排泄分泌物质表面的多糖抗原可作为ES抗原的替代抗原，成为芯片技术的检测抗原，并显示出较高的敏感性与特异性[29]，但因肌幼虫期ES抗原存在诸多弊端及该技术的局限性，仍无法在临床上进行推广。

3 分子生物学诊断方法

随着PCR技术和核酸序列技术的迅速发展，分子生物学技术逐步运用于旋毛虫的研究。由于特异性强、敏感性高，分子生物学诊断方法也越来越被人们所关注，成为目前最为敏感的诊断方法。

3.1 聚合酶链反应技术（PCR）

目前，PCR技术已应用于旋毛虫的基因诊断、种属鉴定等多个领域，且逐渐发展出常规PCR、实时PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。这种方法的敏感性可达0.1条/g幼虫，比推荐的人工消化法的敏感性高5～10倍[30]，有的甚至能达到0.016条幼虫/g[31]，在旋毛虫病的诊断方面有着广阔的前景。同时，食品监管机构和医学实验室利用这种稳定而简单的方法，可有效检测肉中的旋毛虫。该法快速、敏感性高、特异性强，可同时检测多个肌肉样本，并且节省人力和时间，适用于动物群的流行病学调查，因此PCR方法有望成为旋毛虫病早期诊断的替代方法。但由于目前检测仪器昂贵，且该法对操作环境和人员的要求较高，限制了其广泛应用。

3.2 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术是近年来发展的一种新的核酸扩增技术，不需要PCR技术用的精确仪器，只需要恒温水浴箱并且设计合适的引物，就可以在现场实现高通量快速检测，检测结果明显直观，通过肉眼即可辨认，检测成本低于传统的ELISA方法，因此该法在食品安全方面日益受到重视[32]。现已发明出60 min内进行快速检测的LAMP试剂盒，使其更适用于现场和基层医疗单位使用[33-34]。有研究人员曾以旋毛虫线粒体的大亚基蛋白DNA为目的基因，比较实时PCR、LAMP、常规PCR这3种方法对猪旋毛虫的检测效果。结果表明：实时PCR是一种快速、特异性强、敏感性强的检测工具；LAMP方法的敏感性比常规PCR高10倍，且有快速、易操作、花费少等优点[35]。LAMP技术比PCR技术更适合用于肉类旋毛虫的快速检测，但易出现假阳性[36]，且无法鉴别旋毛虫的地理株。

3.3 基因芯片技术

与蛋白芯片不同，基因芯片技术利用旋毛虫的某个特异性基因可变区来设计引物及探针，点样于玻片，制成基因芯片，旋毛虫的DNA经过引物扩增后与芯片上的探针杂交，然后通过扫描图像判断是否检测到旋毛虫。张媛等[37]曾利用这种方法进行3种寄生虫的检测，结果显示，探针特异性高，敏感度约为15 ng/mL，而旋毛虫的敏感性达1条/200 mg。另外，杨朋欣等[38]建立了一种基于双重PCR的液相基因芯片检测方法，来同时检测食品中的弓形虫和旋毛虫，结果灵敏度和特异性较高，分别为65.6 ng/mL和39.06 ng/mL，重复性良好，为食源性寄生虫的检测提供了新的思路与方法。

4 小结

旋毛虫的生存能力强、宿主范围广，引起的临床特征不具特异性，其诊断方法也不够完善，导致了旋毛虫病从首次发现至今180多年来，依然在全世界范围内流行。加强动物检疫，杜绝病肉流入市场，同时对人体旋毛虫病早诊断、早治疗，对减少畜牧业损失、增进人类健康、减少人类重大公共卫生事件意义重大。对于屠宰动物旋毛虫病的检验，OIE法定的检验方法为镜检法及集样消化法，目前我国也在使用这2种方法，但这2种方法均存在一定的弊端：镜检法费时、费力且敏感性差；集样消化法虽可提高检出率，但操作复杂。可结合免疫学方法，提高结果的可靠性。分子生物学方法敏感性高、特异性强，有可能成为替代传统检验方法的新型检测手段。人体旋毛虫病仍通过肌肉活检发现幼虫或包囊来确诊，然而轻度感染及感染早期往往不易被检出，且不易被人们接受。分子生物学诊断方法受样本采集、仪器设备等因素的影响，也无法在临床上得到有效应用。免疫学方法，如ELISA，是最为敏感的方法，然而由于目前所采用抗原的局限性，如虫体及其排泄分泌物抗原不宜大量制备，来自肌幼虫期的抗原存在检验盲区与非特异性等特点，致使免疫学方法始终未被纳入法规方法。所以，寻找一种敏感性和特异性高、稳定性好，可大量制备，可用于早期诊断且节省人力物力的重组抗原，是未来研究中亟待解决的问题。

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（责任编辑：杜宪）

Research Progress of Diagnosis Methods about Trichinellosis

Zhai Chengcheng，Chen Jiaxu，Chen Shaohong，Wu Xiuping
（National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention；WHO Collaborating Centre for Tropical Diseases；National Center for International Research on Tropical Diseases，Ministry of Science and Technology；Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health，Shanghai 200025）

Trichinellosis caused serious harm to human health and animal husbandry. Diagnostic methods of animal and human´s trichinellosis were introduced in this paper，including etiologic diagnosis methods（including compression microscopy and sample digestion method），immunological diagnostic methods（including antibody detection，detection of circulating antigen and protein chip technology），molecular diagnosis methods（including polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplif i cation）and gene chip technology. The advantages and disadvantages of existing research methods were analyzed，in order to provide a theoretical reference for a rapid，eff i cient，convenient and accurate diagnostic methods.

Trichinella spp.；Trichinellosis；diagnosis method

S852.73

：A

：1005-944X（2017）06-0068-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.021

国家科技重大专项（2012ZX10004220）