蜜蜂耐寒性及其机理的研究进展

秦 明 王红芳 刘振国 王 颖 胥保华

（山东农业大学动物科技学院，泰安271018）

蜜蜂耐寒性及其机理的研究进展

秦 明 王红芳 刘振国 王 颖 胥保华

（山东农业大学动物科技学院，泰安271018）

低温是影响蜜蜂繁殖情况、分布范围、扩散速度的关键因子。蜜蜂的耐寒性是指蜜蜂耐受低温的能力，影响蜜蜂耐寒性的因素很多，包括低温驯化、环境湿度、地理条件等等。针对不同的低温环境，蜜蜂会采取不同的耐寒策略，主要可以通过降低体内含水量、积累脂类物质等方法提高自身的抗寒能力。因此了解蜜蜂耐寒性及其机理，对于掌握其在当地分布范围、发生时期和消长动态具有重要意义；亦可根据蜜蜂耐寒机制采取低温驯化等措施，提高本地越冬蜂群的耐寒性，减少越冬蜂的死亡率，为翌年蜂群春繁奠定良好的基础。

蜜蜂；昆虫；耐寒性；耐寒机制

1 前言

耐寒性是指有机体长期或短期暴露在低温环境下的存活能力，这种存活能力因不同的发育阶段、季节因素、遗传因素、营养因素以及暴露于低温环境的时间长短而变化[1]。不同昆虫对于不同的低温环境，会采取不同的耐寒机制；同种昆虫的不同个体，不同发育阶段的耐寒性也不尽相同。通常昆虫适应低温环境的策略有两类：行为对策和生理对策。前者是通过飞行或者爬行等行为活动寻找避寒保暖的场所，例如在冬天来临之际通过迁徙或进入土壤等方式来躲避严寒；后者则是通过生理生化机制来增强耐寒性能[2]。而蜜蜂则是将两种对策有效结合起来：首先蜜蜂是一种社会性昆虫，群居生活，越冬期蜂群聚集成团，达到产热和保温的效果；另一方面蜜蜂会启动自身耐寒系统应对寒冷环境。周冰峰等报道，气温低于14℃的花期，中华蜜蜂的出勤数是意蜂的三倍，明显高于意大利蜜蜂。工蜂采集飞行的最适温度为18～30℃，气温低于9.5℃，意蜂停止巢外活动，低于6.5℃中蜂停止巢外活动。由此可见不同蜂种对于低温的适应性也有所差异[3]。

2 耐寒机制

不同昆虫具有不同的耐寒性机制，其主要是通过生态适应和生理生化适应的相互协调，并与昆虫体内多种化学物质相互作用形成昆虫耐寒系统。新模式昆虫蜜蜂，在应对寒冷环境刺激时也不例外，具体主要表现为可通过降低过冷却点，减少体内含水量，排除体内冰核物质和积累耐寒物质等方式来抵抗冻害[4]。

2.1 降低体内含水量

昆虫体内含水量是昆虫准备越冬的信号之一[5]，许多昆虫在冬季来临之前会大量脱水，从而引起机体耐寒保护物质积累、血淋巴中溶质成分浓度升高、冰点（freezing point,FP）和过冷却点（supercooling point,SCP）降低，继而提高昆虫耐寒力。与大多昆虫类似，蜜蜂在寒冷冬季来临时也会降低体内自由水含量，增加结合水含量的同时减少总含水量。2012年宋修超等人研究发现，变温贮藏僵蚜对烟蚜茧蜂与恒温4℃贮藏相比变温贮藏使烟蚜茧蜂不同程度的降低过冷却点的同时，其体内的含水量也显著低于恒温贮藏[6]；同时比较越冬前后短舌熊蜂耐寒力的变化以及含水量的变化，越冬蜂王的含水量明显低于处女王，而耐寒力却显著提高[7]。Lundheim和Zacharaissen研究发现与耐受结冰型的昆虫相比，避免结冰的昆虫体内自由水散失的更快[8]。这表明通过降低体内水分来降低冰点是昆虫提高自身耐寒性的策略之一，因此，蜜蜂体内游离水分的含量应当作为评价其耐寒性的重要指标之一。

2.2 积累体内脂肪类物质

蜜蜂体内的脂肪含量与其耐寒能力密切相关，总脂肪含量也与过冷却点呈负相关。其中膜脂类组成成分的季节性变化与在低温条件下维持膜功能有关。低温条件下膜成分中的磷脂所含总饱和脂肪酸增加，而不饱和脂肪酸下降[9]。例如，常志光等研究证明：卡尼鄂拉蜂越冬蜂的过冷却能力与体内游离脂肪酸的含量变化呈正相关，即过冷却能力随游离脂肪含量的升高而增强，表明其含量变化影响着越冬蜂的耐寒性[10]；对椰心叶甲啮小蜂进行短时低温处理后，虫体内的脂肪含量由0.08 μg/mg上升到0.11 μg/mg，差异极显著。因此低温处理后椰心叶甲啮小蜂虫体内脂肪积累，说明脂肪是该虫的抗寒应答物质之一[11]。但也有研究证明越冬期二化螟幼虫游离脂肪和结合脂肪含量分别与同期过冷却点呈正负相关，即过冷却点随着游离脂肪酸含量的升高而降低[12]，这两种截然相反的情况可能与昆虫的种类不同有关。

2.3 积累小分子耐寒物质

目前已报道的昆虫体内的小分子耐寒物质包括甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇（可能是阿拉伯醇或核糖醇）、海藻糖、葡萄糖、果糖、氨基酸和脂肪酸等[13]。它们不仅在维持细胞膜和生物大分子的结构和功能上具有重要作用，而且可有效降低包括蜜蜂在内的多种昆虫的过冷却点，提高其耐寒能力。如梁中贵等研究显示松阿扁叶蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)越冬幼虫血淋巴内丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸等氨基酸的含量在越冬过程中均明显增高，证明它们是松阿扁叶蜂在越冬过程中重要的耐寒物质[14]。越冬后赤松毛虫与越冬前相比，虫体和血淋巴海藻糖含量分别增加了150.90%和184.18%，山梨醇含量分别比越冬前增加943.07%和643.88%[15]，表明海藻糖和山梨醇等小分子糖在昆虫耐寒过程中扮演了重要的角色。

2.4 大分子抗冻蛋白的表达

耐寒性物质除了上文提到的小分子物质以外，还有一类重要的大分子物质，即抗冻蛋白[16]。近年来，在一些生物体内发现了各种与昆虫耐寒性相关的抗冻蛋白（AFP），如热激蛋白、冰核蛋白、脂蛋白、抗冻蛋白（或称为热滞蛋白）。这些影响冰核形成和稳定的蛋白，统称为冰活性蛋白。其中作为近年来研究热门的热激蛋白在鞘翅目昆虫中了解比较透彻，它是昆虫在低温胁迫下诱导产生的，而且在不同冷强度的刺激下表达的热激蛋白的种类和含量不同，根据分子量以及同源氨基酸序列，可被区分为HSP90、70、60、40以及小分子热激蛋白(sHSPs)家族，其对于提高新合成的多肽链的正确折叠以及防止蛋白质降解有重要作用[17]。抗冻蛋白是一类能够控制冰晶生长，抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质，可依附到晶核或冰核物质表面，以非依数性形式降低水溶液的冰点和过冷却点[2]。其中Graham克隆了多种抗冻蛋白的核苷酸序列，并对不同来源的抗冻蛋白进行比较和分析，分离纯化了编码抗冻蛋白分子的cDNA[18]；在膜翅目昆虫里，麦蛾柔茧蜂在27.5℃和17.5℃温度条件下，前者Hsp70B4基因明显高于后者[19]。热激蛋白家族中不同成员可能对蜜蜂耐热和耐寒起到的功能不同。张媛英试验结果显示中华蜜蜂在4℃时Hsp22.6的相对表达量与在25℃情况下相比呈现上调趋势，表明Hsp22.6可能在蜜蜂耐寒功能上有一定作用[20]。刘昭华测定中华蜜蜂Hsp24.2的相对表达量在43℃时相对于对照组显著上调，说明Hsp24.2的高表达明显提高了中华蜜蜂热耐受性[21]。与热激蛋白相比，抗冻蛋白在蜜蜂耐寒研究中还未曾有过相关报道。

3 蜜蜂耐寒性的研究方法

温度低于蜜蜂体液冰点时，体液仍能保持液体状态的现象即过冷却现象。其中过冷却点是昆虫耐寒性的一个重要指标[22]，过冷却现象可以通过其来量化。在温带和寒带地区，冻结温度通常低于冰点，绝大多数昆虫可以通过降低过冷却点的方式增加耐寒力，避免结冰造成伤害。例如随着纬度的升高，桉树枝瘿姬小蜂的过冷却点和冰点都呈现降低的趋势，并且在12月份到3月份其过冷却点和冰点随着温度的升高而升高。同样在中国长沙地区中华蜜蜂3月份的过冷却点和冰点显著低于11月份[23]。李志勇针对越冬期东西方蜜蜂的过冷却点进行了测试并对其与越冬性能的关系进行了分析。结果发现：在越冬期，东西方蜜蜂存在过冷却点且二者差异显著，东方蜜蜂过冷却点明显低于西方蜜蜂，相比而言东方蜜蜂表现出对低温更强的适应性和应变能力，更易抗寒越冬。以上结果表明不同蜂种以及同一蜂种在不同季节的耐寒性能都存在些许差异[24]。总之，蜜蜂可以通过降低过冷却点，增强自身过冷却能力，获得较强耐寒性。

当蜜蜂虫体温度低于过冷却点时，体液开始自发结冰，此时，虫体耐寒系统开始发挥作用，向外界释放热量。通过对释放的热量测定，可以方便测出蜜蜂的过冷却点。根据秦玉川提出的热敏电阻结合数字万用电表的方法智能化[25]，现在以低温恒温槽为制冷源，用NTC-TD热敏电阻+数据采集器,可以方便直观的测出蜜蜂的过冷却点。此方法拥有灵敏度更高、精简自动化的优点。国内利用该方法已成功测定了许多昆虫的过冷却点，也取得了一定成果。

4 影响蜜蜂耐寒性的因素

4.1 低温驯化

低温驯化是指昆虫在经历一个较温和的低温后，能够增强抵耐低温伤害的能力[26]。与在自然条件下，昆虫在越冬之前都要经历一个温度渐变的过程，为其度过寒冷环境做好准备的机理相似。根据低温下驯化时间的长短，可将其分为长时间的驯化和短时间的驯化两种[27]。前者主要应对于间接冷伤害和结冰伤害；后者应对于直接伤害和冷休克[28]。在冷驯化后，蜜蜂进入滞育或休眠状态，体内开始积累甘油和其他小分子耐寒物质（糖，醇）等抗冻保护剂，从而增强了机体的耐冻能力。张烨研究表明驯化时间和温度交互作用对玉米螟赤眼蜂的冷藏后出蜂情况影响显著，当15℃驯化10 d后冷藏，出蜂卵数达到峰值为66.75±3.50，其出蜂率为（64.91±2.04）%；当 10℃驯化 20 d后冷藏，出蜂卵数为56.75±4.84，出蜂率达到峰值为（75.50±6.78）%，最佳低温驯化条件为15℃驯化10 d[29]。曾经也有报道低温驯化对阿里山潜蝇茧蜂(Fopius arisanus)耐寒性能影响明显，结果显示，阿里山潜蝇茧蜂雌雄成蜂SCP、FP均随驯化时间的延长呈先升高后下降的趋势，当处理时间为24 h时，雌雄成蜂SCP、FP均达到最高值，与对照差异显著[30]。可见其他条件不变的情况下，低温驯化提高了蜜蜂低温条件下的存活率。

4.2 地理条件

不同地理环境的气温变化间接地导致蜜蜂耐低温性能差别，蜜蜂在长期的进化中形成一种规律性的模式，地理条件对种群扩大其分布有非常重要的生态意义。像高海拔及高纬度地区的蜂种耐寒力较低海拔低纬度地区强很多，即使相同的蜜蜂处在不同纬度其耐寒力也不尽相同。研究表明在低纬度的日本松黄叶蜂卵的SCP为-30.8℃，而在高纬度的爱沙尼亚却下降-40.6℃。在我国东北地区，本地的蜂群越冬期长达半年，其抵御严寒的耐寒能力远比生活在南方温暖环境下的蜂群强。

4.3 环境湿度

环境湿度主要包括空气和土壤等小环境栖息地湿度，这些小环境栖息地湿度对蜜蜂的耐寒性有一定的影响，其主要是通过环境中冰晶对虫体的接种效应：当虫体与外界冰接触时，体内的过冷却液与冰之间就产生了水蒸气的压力差，促使体内的水以蒸汽形式沿孔道外渗，并直接凝聚到冰上,使冰沿孔道向内延伸，当延伸进入体内水相时接种引起体内结冰。Danks等人研究表明，潮湿环境可以使昆虫过冷却能力大大降低[31]。

4.4 发育阶段

有报道显示短舌熊蜂幼虫期耐寒力最低,其次是蛹，工蜂和雄蜂，处女王较高[7]。蜜蜂虫卵发育的最适温度范围约为34～35℃，超出该温度范围虫卵将无法正常发育，而成蜂适温能力相对较强，在14～40℃的温度范围内均能存活。也有报道显示甜菜夜蛾在低温条件下的生存能力随着发育阶段的变化而有较大的差别，结果显示耐寒能力由弱到强的顺序分别为卵＜成虫＜幼虫＜蛹[32]。上述试验充分说明处于不同发育阶段的蜜蜂，耐寒性可能有所差异。

4.5 其他因素

研究表明，蜜蜂的低温耐受能力还存在明显的季节变化，可见季节变迁也是影响蜜蜂耐寒性能的因素之一。除此之外，蜂群群势、健康状况、营养储备、病害感染情况等均是影响蜜蜂耐寒性能的因素。在养蜂生产中，我们经常发现健康蜂群的越冬性能要优于染病蜂群，强群的越冬性能优于弱群，饲料充足的蜂群越冬性能优于缺饲料的蜂群。因此，养蜂人可以根据蜂群群势、饲料储备、蜂病等的周年消长情况调节蜂群抗寒性能。

5 应用价值

蜜蜂耐寒性能的高低是影响其繁殖情况、越冬死亡率、分布范围、扩散速度等的重要因素，掌握蜜蜂耐寒性能及其机制有利于科学判断蜜蜂的季节性消长动态。在养蜂生产中通过调节营养条件、低温驯化等能影响蜜蜂耐寒性能的因素，提高本地越冬蜂群的耐寒性，减少越冬蜂的死亡率，为翌年蜂群春繁奠定良好的基础。

[1]Lee Jr R E.Insect cold-hardiness:To freeze or not to freeze[J].Bioscience,1989,39(5):308-313.

[2]韩召军，王荫长，尤子平.陆生昆虫的抗耐寒性机制[J].昆虫知识，1989,26(1):34-42.

[3]周冰峰，许正鼎.蜜蜂低温采集活动的研究 [J].中国蜂业,1988(5):7-9.

[4]陈豪，梁革梅，邹朗云，等.昆虫抗寒性的研究进展[J].植物保护，2010,36(2):18-24.

[5]Zachariassen K E.The water relations of overwintering insects[M]//Insects at low temperature.Springer U S,1991:47-63.

[6]宋修超，崔宁宁，郑方强，等.变温贮藏僵蚜对烟蚜茧蜂耐寒能力的影响[J].应用生态学报，2012,23(9):2515-2520.

[7]程尚，耿金虎，和绍禹.短舌熊蜂及红光熊蜂耐寒力侧定[J].昆虫知识，2009,46(2):289-293.

[8]Low temperature biology of insects [M].Cambridge University Press,2010.

[9]Haubert D，M M Hggblom，S Scheu，et al.Effects of temperature and life stage on the fatty acid composition of Collembola[J]．European Journal of Soil Biology，2008，44(2):213-219.

[10]常志光，李志勇，高寿增，等.卡尼鄂拉蜂越冬期体内水分，蛋白质，脂肪的变化与抗寒性的关系研究[J].蜜蜂杂志，2008(1):6-7.

[11]郭东峰.低温胁迫对椰心叶甲啮小蜂种群影响及机理[D].海南：海南大学，2013.

[12]强承魁，杜予州，于玲雅，等.水稻二化螟越冬幼虫耐寒性物质的动态变化[J].应用生态学报，2008,19(3):599-605.

[13]李学荣.昆虫人工诱导滞育及其利用的研究进展[J].森林病虫通讯，1998(1):35-37.

[14]梁中贵，孙绪艮，张同心，等.松阿扁叶蜂越冬幼虫体内氨基酸含量变化与抗寒性的关系 [J].山东农业大学学报（自然科学版），2003,34(4):467-470.

[15]韩瑞东，孙绪艮，许永玉，等.赤松毛虫越冬幼虫生化物质变化与抗寒性的关系[J].生态学报，2005,25(6):1352-1356.

[16]积木久明.昆虫はどのようにして寒さをのぐか[J].化学と生物,1994,32(9):583-585.

[17]孔璐，郭建英，周忠实，等.昆虫冷驯化机制研究进展[J].应用昆虫学报，2013,49(6):1664-1669.

[18]Graham L A,Liou Y C,Walker V K,et al.Hyperactive antifree protein from beetles[J].Nature,1997,388(6644):727-728.

[19]陈浩梁.麦蛾柔茧蜂规模化人工饲养的关键技术及其冷胁迫的反应机制[D].湖北：华中农业大学,2011.

[20]Yuanying Zhang,Yaling Liu,Xulei Guo,et al.sHsp22.6,an intronless small heat shock protein gene,is involved in stress defence and development in Apis cerana cerana[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2014,53(2):1-12.

[21]Zhaohua Liu,Pengbo Yao,Xingqi Guo,et al.Two small heat shock protein genes in Apis cerana cerana:characterization,regulation,and developmental expression[J].Gene,2014,545(2):205-214.

[22]侯柏华，张润杰.桔小实蝇不同发育阶段过冷却点的测定[J].昆虫学报，2007,50(6):638-643.

[23]韩鹏飞，吴建辉，邱宝利，等.桉树枝瘿姬小蜂的耐寒性测定[J].应用昆虫学报,2012,49(6):1553-1558.

[24]李志勇，薛运波，王志，等.东西方蜜蜂越冬期过冷却点的测试及过冷却点与越冬性能的关系[J].蜜蜂杂志，2006(11):12-13.

[25]秦玉川，杨建才.一种便携式测定昆虫过冷却点的方法[J].昆虫知识，2000,37(4):236-238.

[26]Hoffmann A A,Sorensen J G,Loeschcke V.Adaptation of Drosophila to temperature extremes:bringing together quantitative and molecular approaches[J].Journal of Thermal Biology,2003,28(3):175-216.

[27]Wang X,Kang L.Rapid cold hardening in young hoppers of the migratory locust Locusta migratoria L.(Orthoptera:Acridiidae)[J].CryoLetters,2003,24(5):331-340.

[28]Salt R W.Principles of insect cold-hardiness[J].Annual Review of Entomology,1961,6(1):55-74.

[29]张烨，连梅力，李唐，等.不同低温驯化条件对玉米螟赤眼蜂低温贮藏的影响[J].中国生物防治学报，2016,32(2):277-281.

[30]郭俊杰，季清娥，黄居昌，等.低温驯化对阿里山潜蝇茧蜂的影响[J].环境昆虫学报，2014,36(1):28-32.

[31]Danks H V.Overwintering of some north temperate and Arctic Chironomidae:I.The winter environment[J].The Canadian Entomologist,1971,103(04):589-604.

[32]江幸福，罗礼智，李克斌，等.甜菜夜蛾抗寒与越冬能力研究[J].生态学报，2001,21(10):1575-1582.

Research progress on insect resistance to cold and its mechanism

Qin Ming,Wang Hongfang,Liu Zhenguo,Wang Ying,Xu Baohua
(Department of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018)

Low temperature is the key factor that affects the reproduction,distribution range and diffusion rate of the honey bee.Cold resistance is the ability of withstanding low temperature and there are many factors that affect the cold tolerance of the honey bees,including low temperature acclimation,environmental humidity,geographical conditions and so on.According to different low temperature environment,the bees will adopt different cold resistant strategy,mainly through the reduction of the body water content,accumulation of lipid substances and other methods to improve their ability of cold resistance.Studies on the cold tolerance and its mechanism of bees have important significance in grasping the local distribution,the occurrence period and the dynamics of the growth and decline.At the same time,take measures such as cold acclimation according to the mechanism of cold hardiness,improve cold resistance of local overwintering bees,reduce overwintering mortality,lay a good foundation for the breeding of colony in spring.

honey bee;insect;cold hardiness;mechanism of cold resistance

国家蜂产业技术体系建设专项资金（CARS-45）；山东省农业良种工程项目（2014-2016）

秦明，硕士研究生，研究方向为特种经济动物饲养与营养，E-mail:736906976@qq.com

胥保华，教授，博士生导师，主要从事蜜蜂科学和动物营养科研工作，E-mail:bhxu@sdau.edu.cn