空肠弯曲杆菌特异性基因研究综述

王艳波，郭光礼，张云香，王晓颖，庄桂玉，龚振华

（1. 临朐县畜牧局，山东临朐 262600；2.临朐县职业教育中心学校，山东临朐 262600；3.青岛市黄岛区畜牧局，山东青岛 266000；4. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

空肠弯曲杆菌特异性基因研究综述

王艳波1，郭光礼1，张云香2，王晓颖1，庄桂玉3，龚振华4

（1. 临朐县畜牧局，山东临朐 262600；2.临朐县职业教育中心学校，山东临朐 262600；3.青岛市黄岛区畜牧局，山东青岛 266000；4. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

空肠弯曲杆菌是人兽共患病原菌，对公共卫生安全和畜牧业，特别是养鸡产业造成一定危害。本文从基因研究的角度出发，对空肠弯曲杆菌的病原生长与流行病学特征、致病机理、致病基因、检测技术、耐药性、防治等方面的研究现状进行了综述，以期对我国空肠弯曲菌肠炎的防治工作提供借鉴。

空肠弯曲杆菌；特异性基因；耐药性

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是弯曲杆菌属的一种，属革兰氏阴性菌，呈弧形、螺旋形、海鸥展翅形或S型。空肠弯曲杆菌是人兽共患病原菌，广泛分布于自然界，可通过动物、水、禽肉制品及蛋、牛奶等传播。空肠弯曲杆菌可引起人体急性肠炎、发烧及Guillain-Barri综合征，也可引起感染动物腹泻和肝炎等。作为一种食物源性的肠道致病菌，其引起的疾病在世界各国广泛存在[1]。空肠弯曲杆菌主要通过饮水、饮食等方式传染给动物和人类，其感染病例数甚至超过了沙门氏菌和志贺氏菌[2]。本文从病原生长与流行病学特征、致病机理、致病基因、检测技术、耐药性、防治等方面，对空肠弯曲杆菌研究现状进行了综述。

1 病原生长与流行病学特征

空肠弯曲杆菌是微需氧菌，在大气或厌氧的环境下不能生长，在5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气的环境中生长最为适宜。空肠弯曲杆菌不能使用糖类作为能量源，但是可以利用富马酸盐、硝酸盐、亚硫酸盐等化合物作为能量源。在潮湿、少量氧的情况下，空肠弯曲杆菌于4℃可以存活数周，于-20℃可以存活2~5个月，但在室温下仅能存活几天。空肠弯曲杆菌对酸碱度具有较高的耐受力，能够轻易通过胃肠道并生存，但对物理和化学消毒剂均敏感。

空肠弯曲杆菌属肠道寄生菌，大量存在于野生动物或家养动物的肠道内。当饲养管理不良，尤其是在转群、注射疫苗、气候突变等应激因素刺激时，该菌可在动物体内大量繁殖，从而引起发病。空肠弯曲杆菌在动物体内具有较高的分离率。鸡是空肠弯曲杆菌的主要宿主，也是空肠弯曲杆菌病的重要传染源，不良的饲养管理，可致使本菌大量繁殖。此外，消费卫生状况与空肠弯曲杆菌的流行紧密相关。随着养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，抗生素使用越来越广泛，空肠弯曲杆菌对人的感染引起了全世界的关注。

空肠弯曲杆菌对人的感染率不亚于沙门氏杆菌和志贺氏杆菌，引发的食品安全和食源性疾病问题日益突出。食入被污染的食物和水以及与动物的直接接触，都是空肠弯曲杆菌的主要传播途径。空肠弯曲杆菌通过动物带菌者或者患者的粪便进入水环境中后，可以进入一种被称为“活的非可培养”（VBNC）状态的休眠期。处于VBNC状态的细菌在特定条件下可以复苏并具有致病性。龚筱丽[3]研究发现粪便及脏器中的空肠弯曲杆菌会在短时间内崩解，因此从脏器中分离本菌首选肝脏及胆汁。

2 致病基因

以前人们对空肠弯曲杆菌的发病机制还不完全明确。研究发现，空肠弯曲杆菌可引起牛和绵羊流产，引起家禽患肝炎，剖检变化主要以肝脏出血和坏死为特征。当饲养管理不良或机体受到应激因素刺激时，空肠弯曲杆菌可在动物体内大量繁殖，并通过粘附、趋化、定植和侵袭等方式，产生毒素并分泌致病蛋白。

研究证实空肠弯曲杆菌的毒力基因是主要的致病因素。空肠弯曲杆菌的鞭毛也是一种毒力因子，并且是该菌能够粘附到肠道上皮细胞的关键所在。空肠弯曲杆菌鞭毛的调节中心包含传感器FlgS，反应调节器FlgR，空肠弯曲杆菌的调节器f l iA、 rpoN，以及持家基因rpoD，通过这些调节中心共同协作表达大量与运动性、蛋白分泌和侵入相关的基因。

空肠弯曲杆菌主要的结合因子是纤连蛋白结合外膜蛋白CadF、自动转运蛋白CapA、胞质结合蛋白PEB1和表面暴露脂蛋白JlpA。其中，CadF不仅可以通过特异结合肠细胞分离的纤维连接蛋白从而激发对宿主细胞的粘附，而且可以通过激发信号传导途径，引起小GTP酶类Rac1和Cdc42的活化。

弯曲杆菌毒素CDT能引起许多哺乳动物细胞膨胀、延伸、溶胀以及死亡；CdtA和CdtC对于结合宿主细胞至关重要，而CdtB是复合体的活化部分。CDT能诱导人产生趋化性细胞因子IL-8。IL-8能诱导树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞向感染部位趋化，引起肠道炎症。

近年来的遗传学和生物化学研究表明，空肠弯曲杆菌菌体表面脂寡糖（LOS）的核心寡糖末端或者侧链糖基与哺乳动物的某些神经节苷脂结构相似，感染后刺激机体产生LOS抗体，其与神经节苷脂产生交叉免疫反应，导致周围神经损伤。Nguyen等[4]证实LOS抗原刺激机体产生的抗体不仅没有免疫保护性，而且可能介导了神经轴索的伤害，临床上引起软瘫。唾液酸（SA）是脂多糖的组成部分。Xiang等[5]证实了SA是诱导引发格林巴利综合征（Guillain-Barri）的主要抗原表位。唾液酸转移酶基因（cst II）是空肠弯曲杆菌合成神经节苷脂样的LOS必需的基因，改变该基因的活性会影响其携带唾液酸分子的数量及转移的位置。吕嘉敏等[6]研究证实，含唾液酸化LOS的空肠弯曲杆菌入侵细胞的能力显著强于含非唾液酸化LOS的空肠弯曲杆菌。

3 特异性基因及检测方法

常规PCR选用的靶基因有16S rDNA、23S rDNA、鞭毛蛋白基因（f l a A 或f l a B）、含铁细胞转运相关蛋白基因（ceu E）以及细胞致死性膨胀毒素基因（CTD）等。

王振国等[7]通过对空肠弯曲杆菌基因组的保守序列分析，设计引物及Taqman探针，建立了一种针对空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR检测法。该法对空肠弯曲杆菌增菌液的最低检出限为5 CFU/mL，对实际样品的检测限为10 CFU/mL。张康等[8]采用Nested-PCR法，对临床采集的空肠弯曲菌感染鸡样品进行检测，经第1次PCR反应，扩增了长度为1 719 bp的特异DNA条带；进一步取第1次PCR反应产物作为模板，扩增了长度为640 bp的特异DNA条带，从而确保了该PCR诊断空肠弯曲菌感染的特异性和灵敏性，24 h内即可获得检测结果。翟海华等[9]选取空肠弯曲杆菌特异性的外膜蛋白A基因（maqA）和马尿酸基因（hipO）为靶基因，采用双重PCR法，扩增出2个特异片段，大小分别为1 028bp和589 bp。该方法对空肠弯曲杆菌具有特异性。张腾飞等[10]根据弯曲杆菌属细菌细胞致死性膨胀毒素cdtABC操纵的子核酸序列，针对cdtA、cdtB和cdtC 设计并合成了3对特异性引物，用于建立空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR 检测方法。结果表明，扩增cdtB的引物为检测弯曲杆菌属通用，可鉴定弯曲杆菌属细菌，而扩增cdtA和cdtC的引物分别为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌特异性的，能够区分两者的最低检测限分别是120 CFU和100 CFU。孙久鹤等[11]设计并合成了空肠弯曲杆菌马尿酸酶基因（hipO）和结肠弯曲杆菌致死性膨胀毒素基因（cdtC）2对特异性引物，建立并优化了快速检测空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的双重PCR方法，对空肠弯曲杆菌hipO基因和结肠弯曲杆菌cdtC基因的扩增产物的大小分别为653 bp和313 bp，灵敏度可达到6.68×10-2µg/mL。该PCR方法1次能够检测出2种弯曲杆菌，且特异性和敏感性均高。

4 耐药性及相关基因

在人类使用大环内酯类药物治疗疾病期间，发现了耐红霉素空肠弯曲杆菌。Kittl等[12]研究发现，大环内酯类抗菌药物在兽药中的广泛应用加速了这一趋势。Gibreel等[13]、Caldwell等[14]研究发现，大环内酯高水平耐药空肠弯曲杆菌，主要是由于23rRNAV域的A2074C 和A2075G碱基突变所致。由于空肠弯曲杆菌至少含有1个或2个耐甲氧苄啶基因，因此它对甲氧苄啶类药物具有天然的耐药性。

导致空肠弯曲杆菌喹诺酮药物耐药的基因突变大多发生在编码DNA解旋酶的gyrA基因和编码DNA拓扑异构酶的parC基因上。在以上2个基因内均有1个喹诺酮耐药决定区（QRDR），被称为“热点”。在这段区域内产生的DNA突变是导致喹诺酮药物耐药的主要原因。目前研究已经证实的突变部位主要是gyrA第125位，86位碱基发生由C→U的突变，90位碱基发生由G→A的突变，以及70位的碱基发生由G→A的突变。

不同来源空肠弯曲杆菌的分离率和耐药性都有不同程度的差异。潘剑平等[15]研究发现，鸡源空肠弯曲杆菌对各种常用药物存在不同程度的耐药性，但其耐药性存在着明显的地域性差异。同样，各地分离的猪源空肠弯曲杆菌对各种常用药物也不同程度地显示出耐药性且存在明显的地域性差异。杨胜男等[16]研究发现，鸡源和猪源的空肠弯曲杆菌的分离率分别为18.33%和32%；采用E-test药敏试纸条法进行药物敏感性试验，结果发现鸡源和猪源空肠弯曲杆菌对红霉素的耐药性较高，均超过了80%；对萘啶酸和四环素的耐药性超过了50%；鸡源空肠弯曲杆菌对庆大霉素较为敏感，敏感度达到了86%；而猪源空肠弯曲杆菌对阿奇霉素和克林霉素较为敏感，敏感度分别达到81.2%和87.5%。龚振华等[17]研究表明，目前肉鸡空肠弯曲杆菌的流行具有广泛而多样化的特点，红霉素等3种抗菌药对分离的空肠弯曲杆菌表现出较好的敏感性，其他抗菌药对分离的空肠弯曲杆菌则表现出较强的耐药性，特别是目前经常使用的药物，如环丙沙星等均对分离的空肠弯曲杆菌表现出较强的耐药性；过多地使用氟喹诺酮类抗菌药，可能是引起耐药性的重要原因之一；同时发现多数分离株的耐药性表现为8耐至10耐。

空肠弯曲杆菌耐药性存在地域差异，原因可能是不同地区对动物治疗使用或饲料中添加的抗生素药物的种类以及使用方法不同，或对药物的用量标准有所不同；另外与不同地域的饲养条件和水平也有着密切关系。潘洪涛[18]研究表明，大蒜素抑菌作用强于环丙沙星和红霉素。陈振华等[19]研究表明，大蒜素的抗菌活性主要在于其能够与含有巯基的酶相互作用，不可逆地抑制巯基蛋白酶的活性。

5 防治

空肠弯曲杆菌在家禽特别是鸡群中广泛存在。自然条件下鸡群母源抗体的存在大大减少了该菌的感染，证明了疫苗是控制该菌的重要手段，但商品化疫苗尚未出现。目前应用于商品化肉鸡养殖场的主要防治手段主要有以下几个方面：一是饲喂弯曲杆菌高免的软黄抗体；二是特殊的饲料添加剂（益生菌，细菌素，噬菌体，植物源性饲料添加剂等），可以竞争性排斥或者直接杀死家禽肠道内目标弯曲杆菌；三是做好饲养管理的各项细节，给提供鸡群清洁饮水，对病死鸡及时适当处理；四是采取全进全出制，每批饲养完毕彻底消毒。

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（责任编辑：杜宪）

Review on Progress of Specif i c Genes Studies of Campylobacter Jejuni

Wang Yanbo1，Guo Guangli1，Zhang Yunxiang2，Wang Xiaoying1，Zhuang Guiyu3，Gong Zhenhua4
（1. Linqu Animal Husbandry Bureau，Linqu，Shandong 262600；2. Linqu Vocational School，Linqu，Shandong 262600；3. Huangdao Animal Husbandry Bureau，Qingdao，Shandong 266000；4. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Campylobacter jejuniis a zoonotic pathogen，causing a certain degree of hazards to public health and animal husbandry，especially for chicken industry. In this article，the research status ofCampylobacter jejuniwas reviewed on specific genes from the aspects of pathogen growth and epidemiological characteristics pathogenic mechanism，pathogenic gene，detection technology，antimicrobial resistance，and disease control，in order to provide reference for the prevention and control work in China.

Campylobacter jejuni；specif i c gene；antimicrobial resistance

S855.1

B

1005-944X（2017）07-0088-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.025

农业部公益性行业科研专项（201303044）

龚振华