猪伪狂犬病疫苗的研究进展

牛晓芸 赖月辉 黄秋雪 牛贝贝 吴文福

（广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州 511356）

猪伪狂犬病疫苗的研究进展

牛晓芸 赖月辉 黄秋雪 牛贝贝 吴文福

（广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州 511356）

伪狂犬病是影响养猪业的重要传染病，一旦发病很难根除，给养猪业造成严重的经济损失。本病目前尚无有效药物治疗，免疫接种是预防和控制本病的主要措施。本文综述了目前防治伪狂犬病主要使用的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因疫苗3类疫苗，并展望了未来伪狂犬病疫苗的发展方向。

猪伪狂犬病；疫苗；研究进展

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的一种急性烈性传染病，宿主范围广泛，可感染猪、牛、羊和野生动物等[1]。感染猪的临床症状均表现为体温升高。新生仔猪表现为神经症状，消化系统受损害，死亡率高达100%；妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎和呼吸系统临床症状；公猪表现为繁殖障碍和呼吸系统临床症状。本病广泛分布于世界各国，在我国也广泛存在。PRV有极强的免疫逃逸能力，造成免疫系统受到损害，易继发其他疾病，严重威胁养殖业，每年给养殖业带来巨大的经济损失[2]。本病目前无有效的药物治疗，并且PRV引起成年猪的隐性感染。疫苗免疫接种仍是预防和控制本病的主要措施。

早期的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗。随着生物学技术的发展，PR基因苗等新兴疫苗也随之诞生，本文就PR各种疫苗做一简单的综述。

1 灭活疫苗

PR灭活疫苗又称死疫苗，是将PR强毒接种其敏感细胞，待细胞出现典型的病变后，收获病毒，然后利用某些物理或化学方法将PRV杀死，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。灭活疫苗因为病毒已被灭活、安全性好，不存在潜伏感染的隐患，因而在各养猪场，尤其是在种猪场以及未污染的养猪场广泛应用，甚至有些国家和地区对于种猪要求使用灭活苗。

李晓慧等[3]利用PRV四川株研制油佐剂灭活疫苗，试验证明：免疫效果良好，抗体持续时间达6个月。Wang等[4]在PRV AH02LA毒株的基础上缺失gE基因，构建了感染性克隆PRV（LA-AB）株，将该克隆株灭活后加以佐剂制备的灭活疫苗，能提供完全临床保护。PRV可导致母猪的繁殖障碍，很多养殖企业会对母猪进行产前的加强免疫，新生仔猪获得较高的母源抗体，但母源抗体会干扰PR弱毒活疫苗的免疫效果，而免疫接种PR灭活疫苗，则能起到很好的保护作用。舒银辉等[5]用其研制的PR灭活疫苗（HB-J株）以不同剂量免疫健康断奶仔猪，试验结果表明该疫苗能使猪产生良好的体液免疫应答，并且具有一定的剂量依赖性。该学者的研究还介绍了灭活疫苗的缺点：接种灭活疫苗只产生体液免疫，很少或不引起细胞免疫；产生的抗体滴度随着时间而下降，为了得到良好的免疫效果，经常要大剂量注射或者重复免疫接种，给防疫工作带来诸多不便；市售的灭活疫苗大都以白油做佐剂，在机体内不易吸收，接种后偶尔会发生过敏反应；且生产过程也比较繁琐、费用高，故在生产上已经较少使用。

2 弱毒活疫苗

2.1 第一代弱毒活疫苗

第一代弱毒活疫苗为天然基因缺失株，比较经典的是 Bartha-K61株活疫苗和 BUK株 活疫苗 。Bartha-K61株活疫苗是二十世纪六十年代匈牙利Bartha等人将野毒株在鸡胚成纤维细胞上反复传代、筛选噬斑而获得的一个致弱疫苗株，该毒株为gE-基因缺失株，也有研究显示gE-基因相邻的gI也存在部分缺失[6]。Bartha-K61株毒力弱、免疫原性好、遗传特性稳定，是公认的优良疫苗株。在Zhou等[7]的研究中显示，应用Bartha-K61疫苗，无论是一次免疫还是二次免疫都能很好地抵抗PRV经典强毒和野毒株的攻击，而二次免疫后猪只有更好的增重情况。目前我国免疫防控PR应用最多的是Bartha-K61株活疫苗。

另一个经典天然基因缺失毒株BUK也是gE-基因，是亲本毒株在细胞连续传代后致弱而来。20世纪后，许多国家利用亲本野毒株在一定条件下致弱培育了不少PR弱毒疫苗株，如：北爱尔兰的NIA4株、法国Alfort-26株、保加利亚MK25株、俄罗斯lt-21/07株（该毒株是将MK-25弱毒株进一步减弱获得）。

在感染地区，应用第一代弱毒活疫苗进行普遍免疫，在根除的最后阶段对仍然是阳性的猪群进行扑杀，最后实现PRV野毒株的根除。有研究证实，德国东部部分地区应用第一代弱毒活疫苗实现了PRV的净化[8]。

2.2 第二代弱毒活疫苗

自然弱毒疫苗免疫效果好，但其主要毒力基因TK基因并没有缺失，还存在毒力返强、传毒和散毒的风险。随着分子生物学的发展，对PRV基因组研究不断的深入，更进一步了解基因组结构对病毒生物学性质和免疫原性的影响，第二代弱毒活疫苗——基因缺失疫苗应运而生。

PRV基因组为线状双股DNA，只有一个血清型，其毒力由几种基因协同控制，其中TK基因是主要的毒力基因，TK基因一旦失活，PRV对宿主的毒力将明显降低或者丧失，第一个基因缺失弱毒活疫苗就是以TK基因缺失株为毒株制备的[9]，并于1986年在美国批准上市。中国最早进行基因缺失疫苗研究的是四川农业大学生物技术中心，并成功构建PRV Fa株TK基因缺失疫苗株，随后又构建了多株基因缺失疫苗株，同时四川农业大学郭万柱教授团队研制的猪伪狂犬病（基因缺失）活疫苗（SA215）在2003年获得新兽药证书，为我国第一株动物病毒基因工程疫苗。

TK基因为酶蛋白基因，在体内不能产生相应抗体，仅缺失TK基因无法用血清学方法区分野毒感染株和免疫接种株，在TK缺失疫苗的基础上双基因缺失苗、三基因缺失苗、含报告基因的缺失疫苗发展开来。

Quint等[10]1987年构建TK-/gE-双基因缺失株并建立gE-ELISA血清学诊断方法，用于区别免疫接种和自然感染。Kit等[11]在PRV BUK-d13株的基础上，构建缺失TK和gC基因的PRV TK-/gC-疫苗株，PRV BUK-d13株本身存在gE基因缺失，动物在免疫接种该缺失疫苗后不能产生抗gC和gE抗体，用gC-ELISA或gE-ELISA可将免疫接种还是野毒感染动物区分开。何启盖[12]实验室构建TK和gG双基因缺失株PRV HB-98株，生物学特性研究结果表明PRV HB-98突变株双基因缺失株安全性和稳定性好，并能在接种的动物中激发较强的免疫反应，结合gG-ELISA可以区分疫苗接种动物和野毒感染动物。田志军等[13]在Bartha-K61株的基础上构建了 Bartha-K61株 TK基因缺失突变株rPRV-LacZ，该重组病毒表型为gE-/TK-/Lacz+，rPRV-LacZ对3日龄仔猪和绵羊均具有很好的安全性。Dong等[14]以伪狂犬强毒株PRV ZJ01株为亲本，构建TK/gE/gI三基因缺失毒株rZJ01ΔTK/gE/gI株，并对其毒力和免疫原性进行研究。刘正飞等[15]以其实验室分离鉴定的PRV Ea株为基础，构建PRV Ea TK-/gE-/gI-株。胡艳芬[16]以亲本株PRV-JSZ基因组DNA为基础并结合rPRV-TK-/gE-基因组DNA，构建rPRV-TK-/gE-/gN-缺失株。姜焱等[17]在PRV上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上，将绿色荧光蛋白（GFP）和Lac Z基因插入到缺失位置，构建含Lac Z和GFP两种筛选标记的PRV-SH gE-/gI-的双基因缺失病毒株。

但是基因缺失疫苗还存在一个重要的问题，那就是生物安全。病毒在自然状态下可能与野毒株发生基因重组，或者核酸修补，使疫苗株原本缺失的基因恢复而重新获得毒力。

不管是一代弱毒活疫苗还是二代弱毒活疫苗面临的一个共同问题就是疫苗的储存和运输，弱毒疫苗必须低温冷冻保存。现实中由于条件限制，很难保证实时低温，这就大大影响了疫苗免疫效果，所以疫苗研发又延伸了一个新方向——耐热保护剂活疫苗的研发。王颖等[18]用响应面法（RSM）筛选并优化PRV耐热保护剂最佳配方，应用最佳配方冻干的疫苗在2～8℃条件下保存24个月，病毒含量降低不超过0.5个滴度。目前已有PR耐热保护剂活疫苗上市销售。

3 PR新型疫苗

传统的PR疫苗存在不安全性或免疫效果不理想等缺陷，同时不能抵抗潜伏感染和克服母源抗体的干扰，已成为控制和消灭伪狂犬病的关键性制约因素。研制克服传统疫苗缺陷的新型疫苗成为PR防治的迫切期望。以主要保护性抗原为基础的新型疫苗成为研究热点，亚单位疫苗、活病毒载体疫苗、核酸疫苗等新型疫苗，尤其是核酸疫苗，具有诱导抗体全面、无致病性、无潜伏感染的危险等优点，开发潜力大，如果能对其进一步完善，尤其是进一步提高其保护效力、消除潜在生物安全隐患，将有望应用于生产实践，在有效预防和控制猪伪狂犬病中发挥重要作用。

3.1 PR亚单位疫苗

PR亚单位疫苗就是利用基因工程技术将PRV的保护性抗原基因克隆到真核或原核表达系统中，使保护性抗原基因高效表达，用获得的产物制成的疫苗。目前已知的PRV的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能刺激机体产生中和抗体，是研究亚单位疫苗的首选蛋白。

免疫刺激复合物（ISCOM）是一种全新的抗原递呈系统，对机体有免疫增强和抗原递呈双重作用，能同时刺激机体的体液免疫和细胞免疫，是新发展起来的一种亚单位疫苗。叶丽林等[19]以伪狂犬全病毒构建PRV免疫刺激复合物，对兔的保护率为100%。把特定的囊膜蛋白整合入ISCOM中，可以区分免疫动物和野毒感染动物。Tsuda等[20]将PRV的糖蛋白gII和Quil-A基质结合构建ISCOMS，免疫仔猪后能抵抗PRV感染。Tulman提取PRV囊蛋白gC制备ISCOM亚单位疫苗。

亚单位疫苗因不含有核酸物质，比较安全，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与自然感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。但是亚单位疫苗生产成本高，免疫原性不及弱毒活疫苗及灭活疫苗，应用受到限制。

3.2 PR活载体疫苗

PRV宿主范围广，基因组大（约145 kb），含有许多病毒非必需基因，病原离子重组或者缺失后，接种异源动物上进行试验，对异源动物无影响，还能产生综合性抗体。在PRV基因组中插入一个或多个外源抗原基因，插入外源基因后不影响PRV毒株的增殖，获得的重组病毒不仅可以对PR进行免疫预防，还能产生针对其他病原的保护，且免疫原性持久，克服灭活疫苗或弱毒疫苗的诸多缺点。因此，构建其重组病毒或病毒活载体疫苗成为研究热点。

王新等[21]以PRV基因缺失疫苗株SA215为病毒载体，通过同源重组，构建共表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因重组伪狂犬病病毒SA215（C）株，结果表明，免疫小鼠能抵抗PRV Fa和PCV2强毒的攻击。这为研制安全、有效的PCV2-PRV二价基因工程疫苗奠定了基础。钞安军等[22]用PCV2 ORF2基因与猪PRV弱毒HB98株成功构建表达ORF2基因的重组病毒PGO，该重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。徐静等[23]将日本乙型脑炎病毒CQRC-1株的E基因和PRV通过克隆、转染的方法获得了表达JEV E蛋白的重组伪狂犬病病毒，命名为SA215（E）。李自力等[24]以PRV Ea株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒，重组病毒免疫小鼠能诱导乙型脑炎特异性抗体和特异性细胞免疫应答，同时能抵抗PRV强毒的攻击。郑宝亮等[25]将含有H3N2亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）基因的转移载体pLTK-HA与PR疫苗毒株Bartha-K61的基因组共转染Vero细胞，获得了一株重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-HA。rPRV-HA的免疫接种对同亚型SIV攻击具有较好的保护作用。

在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病2型以及猪细小病毒病等重要传染病疫苗的研发过程中，以PRV为载体构建的rPRV-CSFV、rPRV-PRRSV、rPRVFMDV、rPRV-PCV-2、rPRV-PPV等重组疫苗已有大量的研究报道。

活载体疫苗克服灭活疫苗和弱毒活疫苗的部分缺陷，可以同时启动机体体液免疫和细胞免疫，有实现一苗防多病的可能性，具有良好的研究和应用前景。

3.3 PR核酸疫苗

核酸疫苗（nucleic acid vaccine），又称基因疫苗（gene vaceine）或DNA疫苗（DNA vaccine），是将一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接注入动物体内，抗原基因在宿主细胞内表达而激活机体免疫系统。DNA疫苗可同时诱导体液免疫和细胞免疫、易构建与改造、制备工艺简单、不受母源抗体干扰、可以重复使用等，这些优点是传统疫苗无法比拟的。

Motail等于1996年首次将该技术用于伪狂犬病毒的研究。肖少波等[26]以pcDNA 3.1+和pSFV-DNA为载体，构建gC基因的常规DNA疫苗表达质粒pcDC和“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSFVC1.5（pSFVC1.5能诱导转染细胞凋亡）。大量试验结果显示：“自杀性”DNA疫苗产生的中和抗体虽然没有常规DNA疫苗高，但能诱导更强的细胞免疫；在免疫攻毒保护方面，“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗的抵抗PRV Ea强毒株攻击的保护率分别为100%和62.5%，说明“自杀性”DNA疫苗能提供更好的免疫保护。陈懿等[27]以p3XFLAG为载体，分别构建gD基因真核表达质粒p3XFLAG-gD和 p3XFLAG-gD-VP22，分别免疫BALB/c小鼠，二免后攻击PRV Ea强毒，结果两组DNA疫苗对小鼠的保护率分别为87.5%和75%，并且p3XFLAG-gD-VP22质粒能显著诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答。van Rooij[28,29]的试验中将分别含有gB、gC、gD的DNA疫苗免疫新生仔猪，第三次免疫后攻击PRV NIA3毒株，结果显示，PRV-gB DNA疫苗可以诱导包括细胞毒性T细胞反应在内的细胞反应，并且在感染早期可以减少病毒的排泄，PRV-gD DNA疫苗可以诱导强烈的中和抗体反应。另外 van Rooij还进行了gB-gD DNA疫苗诱导新生仔猪免疫反应的研究，结果表明，与常规疫苗相比，gB-gD DNA疫苗，能够诱导仔猪产生更高水平的体液免疫和细胞免疫，并且免疫效果不受母源抗体的干扰。

4 总结和展望

PRV虽然只有一个血清型，但是不同的毒株毒力存在差异；宿主范围广，病毒与不同宿主的作用机制还没有彻底阐明；潜伏感染机制尚不明确，目前还没有一种有效的消除方法，有效的疫苗免疫在PRV的预防中起着至关重要的作用。

理想的疫苗应该有效、安全、通用，可以区分免疫和野毒感染，价格低廉，操作简便等。PR疫苗，目前以灭活疫苗和弱毒疫苗在临床上使用较多，亚单位疫苗、核酸疫苗以及以PRV疫苗株为载体的多价疫苗大多还处于实验室阶段，新型疫苗商品化任重而道远。随着分子生物学研究的不断发展和基因工程技术的广泛应用，对PRV固有免疫逃逸机制的不断发现，期望PR疫苗的研究在不久的将来有更新的突破并应用于临床。

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S852.65

：A

：1673-4645(2017)08-0071-05

2017-07-11

牛晓芸（1986-），女，硕士，兽医师，E-mail：ndsy2010@163.com