黔北麻羊分子遗传标记研究进展

沈洪良（苏州工业园区动物卫生监督所 215021）

黔北麻羊分子遗传标记研究进展

沈洪良（苏州工业园区动物卫生监督所 215021）

分子标记技术已经广泛应用于遗传学、实验动物学及免疫学等研究领域中。本文概述分子遗传标记的种类及其在黔北麻羊中的应用情况，并对分子标记技术应用前景提出展望。

黔北麻羊;分子遗传;标记;育种;研究进展

黔北麻羊是贵州省三大优良山羊品种之一,在贵州三大地方品种独具特色,主要表现在分布地、毛色、体型外貌和生产性能等方面。黔北麻羊历史悠久,发祥较早。以适应能力强、耐粗饲、繁殖率高、肉性能良好、膻味轻、肉鲜美可口、板皮品质优良等优点为当地群众所喜养[1]。

自分子生物技术问世以来,分子遗传标记就为动物遗传育种学家所关注（Mats Hansen等,1997）[2],分子遗传标记被广泛应用于分析动物类群的群体遗传结构、遗传多样性、动物遗传资源的分类、品系鉴定和遗传纯度分析、遗传距离计算、杂种优势预测,遗传关系确定、目的基因标定、数量性状基因的连锁分析、构建基因图谱、疾病诊断等动物遗传育种研究领域。目前应用在黔北麻羊遗传育种中有以下几种。

1 限制性片段长度多态性（RFLP）

1.1 基本原理

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism,RFLP）是由不同基因型中内切酶位点的碱基插入、缺失、重组或突变,利用限制性内切酶消化基因组DNA时会产生大小不同的DNA片段,电泳后通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,同特异的探针进行杂交,最后通过放射性自显影或其他显色技术显示杂交结果,从而揭示出DNA的多态性（Lander,1989,Nienhuis,1987）[3,4]。

1.2 在黔北麻羊育种中的应用

贾永红等[5]（1999）采用15种内切酶酶解贵州山羊的mtDNA,研究贵州省4个山羊品种之间的关系,其品种共93只个体线粒体DNA多态性。其中BamHI、HindⅢ和SalI3种酶的酶切类型存在多态。共检测18种限制性态型,归结为3种mtDNA单倍体,单倍体I和Ⅱ在贵州山羊4个品种中分布频率较高,分别为77.42%和21.50%,单倍型Ⅲ分布频率较低为1.08%：其中白山羊和黑山羊亲缘关系最近,其次为黔北麻羊,而与小香羊的亲缘关系最远。从而推测贵州山羊mtDNA单倍体I和Ⅱ可能来源于两个母系先祖,分时间约在19万年前。

1.3 小结

PCR-RFLP由于其要用到内切酶而使试验成本变大,加之多态含量不高不便于检测未知序列突变等局限性,现在大多数研究者更多的应用其他技术来代替PCR-RFLP。

2 随机引物扩增多态性DNA标记（RAPD）

2.1 基本原理

随机引物扩增多态性DNA标记（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD） 是 Williams（1990）[6]等人通过利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为十聚体）为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,经EB染色或放射自显影来检测其中DNA片段的多态性。

2.2 在黔北麻羊育种中的应用

杨家大等（2002）[7]用扩增猪基因组筛选得到40条多态引物对小香羊、马头羊、川东白山羊和江南黄羊4个品种进行PAPD分析,扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离,结果有28条引物扩增出多态性谱带,并用Nei氏公式计算品种间的遗传距离指数,NJ发构建系统聚类图。结果表明,川东白山羊和江南黄羊之间的遗传距离指数较小,亲缘关系较近,而小香羊与其他山羊品种之间的遗传距离指数较较大,亲缘关系较远。

2.3 小结

相对传统酶学、RFLP等方法,RAPD具有快速、简便[8],无需预知受试基因组DNA序列等优点,并且避免放射性同位素污染。RAPD标记还可以对那些RFLP难以区分的基因区域作遗传连锁图。但RAPD标记的重复性不太令人满意[9],另外RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型[10]。

3 微卫星序列

3.1 基本原理

微卫星序列（Microsatellite DNA）又称为简单序列重复（Simple sequence repeats,SSR）或简单序列（Simple sequences）、短串联重复序列 (Short randem repeat,STR),微卫星序列在动物群体内通常具有很高的多态性,广泛分布于生物体整个基因组,具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、呈孟德尔共显性遗传等特点,被认为是各类遗传标记中最有价值的一种标记（Tautz D等1989,Hamada H等1982）。

3.2 在黔北麻羊育种中的应用

毛凤显（2006）等[11]用15个牛微卫星位点,以波尔山羊为对照,研究4个贵州地方山羊品种（贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊育、榕江小香羊）的遗传背景,结果反应了牛微卫星位点与山羊有较高同源性；贵州地方山羊品种比波尔山羊具有较高的遗传性,高低顺序是贵州白山羊＞贵州黑山羊＞黔北麻羊＞榕江小山羊＞波尔山羊；群体遗传分化大,群体变异主要存在于品种内,而品种间的变异较小；贵州白山羊与贵州黑山羊遗传距离最近,其次是榕江小山羊、黔北麻羊,与波尔山羊遗传距离最远,这与它们的地理分布及品种形成相符。

3.3 小结

微卫星DNA一般位于内含子中,在进化过程中受到选择压力较小,与其他分子标记相比,微卫星DNA在多态性、群体平均杂合度,以及群体间遗传距离等方面,微卫星位点均值高于蛋白质位点。用微卫星标记更适合于其分析。同样更适合于检测个体间的差异。

4 单核苷酸多态性（SNP）

4.1 基本原理

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换（C与T转换,在其互补链上则为G与A互换）或颠换（C与A,G与T,C与G,A与T互换）等变异所引起的DNA序列多态性。SNP是人类可遗传变异中最常见的一种,占所有已知变异的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500～1000个碱基对中就有一个,估计总数有300多万个。总体而言,SNP都是二等位多态性的,转换的发生率总是明显高于其他几种变异,占其他变异的2/3,位于编码区内的SNP（cDNA）比较少,在外显子内其变异率仅及周围序列1/5。不仅如此,SNP在基因组中的分布较微卫星标记广泛的多,而且比微卫星更稳定,尤其是处在编码区时,另外还有易于规模化,自动化分析的优点。

4.2 在黔北麻羊育种中的应用

SNP在黔北麻羊育种中的应用还是比较广泛的,任珍珍罗卫星等（2010）[12]将生长分化因子9（GDF9）基因和骨形态发生蛋白15（BMP15）基因作为候选基因,采用直接测序法检测GDF9和BMP15基因在黔北麻羊中的单核苷酸多态性。罗卫星等（2010）为了研究黔北麻羊GDF9基因多态性与产羔性能的关系,试采用直接测序法对黔北麻羊的生长分化因子9（GDF9）基因外显子2核苷酸多态性及其与产羔数的关系进行分析,结果表明,黔北麻羊群体GDF9基因外显子2的959bp处存在A→C的碱基突变,导致编码氨基酸由谷氨酰胺突变为脯氨酸。

4.3 小结

SNP技术作为第3代分子遗传标记,在遗传多样性检测、遗传图谱构建、QTL定位、候选基因功能分析等方面具有重要作用。SNP技术为数量遗传学提供了大量分子水平的信息,大大推进了家畜育种的步伐。通过利用SNP技术进行数量性状主效基因的定位,充分了解动物的经济性状,促进分子标记辅助育种在生产上的应用,从而推动畜牧业快速有效地发展。在今后研究中,应从已知的与重要经济性状相关的基因着手,研究这些基因外显子、内含子SNP多态性,特别是调控序列上的SNP多态性,这样更容易找到与特定功能相关的分子标记,提高家畜的选择育种的效率。

5 展望

每种分子标记技术都有其他传统标记无法比拟的优越性。随着分子生物学技术的不断发展及基因组的测序完成,分子标记技术将得到逐步改良和完善,达到更加准确、经济、快捷检测的目的,从而成为成熟的遗传分析手段而更适于推广应用,越来越多的应用于黔北麻羊的遗传及应用研究中。

[1]贵州省畜禽品种志编辑委员会.贵州省畜禽品种志[M].贵阳:贵州科技出版社,1993:66-68.

[2]Mats Hansen,Christer Hallden,al.Marker-assisted selection of restored male-fertile Brassica napus plants using a set of dominant RAPD markers[J].Molecular Breeding,1997(3):449-456.

[3]Nienhuis J,Helentjaris T.RFLP analysis of loci.Associated with insect resistance in tomato[J].Crop Science,1987,27:797-803.

[4]贾永红,史宪伟,简承松,等.贵州四个山羊品种mtDNA多态性及起源分化[J].动物研究,1999,20(2):88-92.

[5]Williams J G K,Kubelik A R,Livak J L,ct a.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nuckleic Acids Res,1990,18:6531-6535.

[6]杨家大,简承松,朱文适,等.黔湘渝4个山羊品种亲缘关系的RAPD分析[J].贵州农业科学,2002,30(1):14-17.

[7]Lynch M,Miligan B G.Analysis of population genetic structure with RAPD markers[J].Mol,1994(3):91-97.

[8]Perez T,Albornoz J,Dominguez A.An evaluation of RAPD fragment reproducibility and nature[J].Mol Ecol,1998(7):1347-1357.

[9]Ellsworth D l,Rittenhouse K D,Honeycutt R L.Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns[J].Bio-techniques,1993(14):214-217.

[10]毛凤显,皇甫江云,赵有璋.贵州地方山羊品种遗传背景的微卫星分析[J].畜牧兽医 2006,38（1）:13-15.

[11]任珍珍,罗卫星,蔡惠芬,等.黔北麻羊LHβ基因多态性及其与产羔数的相关性分析[J].山地农业学报,2010,29（2）:135-138.

沈洪良（1986-），男，汉族，本科，兽医师，主要从事兽医、畜牧技术工作。