影响中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）发挥作用的因素分析

梁俏美，马仁舒，李春妹，沈佳程，梁妍雯，刘 伟 （河北医科大学基础医学院，河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室，河北石家庄05007）

影响中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）发挥作用的因素分析

梁俏美1，马仁舒1，李春妹1，沈佳程1，梁妍雯1，刘 伟2（1河北医科大学基础医学院，2河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室，河北石家庄050017）

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种新型免疫防御机制，本文拟探讨影响其发挥作用的因素.通过Pubmed、Embase等数据库检索最新文献，对其进行阅读筛选，收集多种关于影响NETs作用的因素，针对各种因素对NETs作用的影响进行归纳概述.结果发现，影响NETs发挥作用的因素主要体现在促进、诱导、抑制三个方面.综上所述，许多研究表明影响NETs作用的因素与疾病有一定的联系，对其进一步研究可以给临床工作者提供一个NETs参与作用的相关疾病的治疗方向，并为评估疾病预后提供一个诊断工具.

中性粒细胞胞外诱捕网；非特异性免疫；影响因素

0 引言

传统上，中性粒细胞（poly morphonuclear neutro⁃phil，PMN）主要被认为是发生急性炎症时第一个被招募到炎症组织的免疫细胞，亦是由巨噬细胞分泌的趋化因子吸引聚集至局部细胞接触微生物病原体的感染部位.相比之下，它们在慢性炎症中的重要性仍缺少深入研究，因此吸引了Soehnlein等［1］的研究.现今，一种新型防御机制——中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellar traps，NETs），为宿主细胞捕获和杀灭胞外微生物提供了一种新的途径，在先天性免疫系统中起着重要的作用，并且在血液循环中的嗜中性粒细胞形成不稳定的聚集体能引发对炎症介质的强烈反应［2］，这能促进各种炎症和自身免疫疾病发病.PMN能释放NETs并死于NETosis.NETosis是一种细胞凋亡途径，它能释放由染色质，组蛋白和颗粒蛋白组成的网状细胞结构，延缓小鼠和人类的糖尿病性伤口愈合［3］.近年来Jorgensen等［4］研究发现，细胞间存在清除已捕获细菌的细胞的特异性免疫功能，并具有通过促进淋巴细胞增多来清除嗜中性粒细胞的焦磷酸细胞碎片机制.因此，NETs参与着各种相关疾病的发生发展过程，寻找可靠的影响NETs形成的因素对提高相关疾病的治疗有很大帮助.

1 促进或诱导NETs形成的因素

1.1 蛋白质

1.1.1 氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lip⁃oprotein，oxLDL） Awasthi等［5］研究发现PKC和IRAK为MAPK途径的上游能阻断Toll样受体2和6，使oxLDL诱导形成的NETs显著减少.同时发现oxLDL以浓度和时间依赖性方式诱导NETs释放，其中大多组分有诱导NETs释放的潜力，如氧化磷脂是最有效的NETs诱导剂，并且可能对oxLDL介导NETs释放非常关键.然而，另外组分如氧固醇，丙二醛和4⁃羟基壬烯醛与氧化磷脂相比效力较低.这些也预示着oxLDL在不存在微生物刺激的情况下可作为NETs的潜在诱导剂，从而加重相关疾病的病理生理状况.

1.1.2 P⁃选择素 已有研究表明，P⁃选择素是介导血小板与中性粒细胞相互作用的最重要的分子，它主要通过P⁃选择素糖蛋白配体1（P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1，PSGL⁃1）触发PMN的活化信号，从而诱导PMN活化和NETs释放.P⁃选择素能促进嗜PMN中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，这一过程对该选择素诱导NETs形成有着十分关键的作用［6］，该发现进一步支持了P⁃选择素/PSGL⁃1抑制剂治疗剂的临床发展，可有效地减少病理性血栓形成和炎症发生.最近，Panicker等［7］实验发现，升高的血浆sP⁃选择蛋白仅是一个后果，而不是心血管疾病发生的原因.这从侧面可以看出P⁃选择素及其相关分子在导致血栓形成的过程中，有着加速疾病发生发展的作用.

1.1.3 CD11b/CD18配体 PMN是哺乳动物机体内重要的天然免疫细胞，作为宿主防御的第一道防线，PMN通过模式识别受体（pattern recognition recep⁃tors，PRRS）感知病原，识别病原相关分子模式（pathogen⁃associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage⁃associated molecular pat⁃terns，DAMPs），启动机体先天免疫反应如NETs机制［8］.CD11b/CD18介导的细胞吸附是细胞发挥免疫功能所必需的.正常情况下，CD11b/CD18没有吸附性，其以一种未活化、低亲和力状态存在，通过构象弯曲，配体结合位点不能获得潜在的配体，当细胞被LPS、IL⁃8等因子激活以后触发细胞内信号级联反应，通过构象改变引起胞质尾部的分离，致使整合素打开，暴露配体结合位点，使高亲和性CD11b/CD18能够与配体结合介导PMN吸附、渗出［9］，从而有利于阻止病原微生物的入侵，发挥着机体感染与抗感染的重要作用.

1.2 病原体

1.2.1 阿米巴 2016年6月Ventura⁃Juarez等［10］首次证实溶组织阿米巴营养体能直接体外接触并激活人PMN释放NETs.溶组织阿米巴营养体膜上的脂肽磷酸聚糖可被PMN膜受体TLR2和TLR4识别，从而诱导活性氧和氮物质的产生.研究发现，用TNF⁃α和IFNc处理人PMN后会发生以上反应.另外，充分活化的PMN能在抵抗溶组织阿米巴滋养体侵袭的过程中诱导NETs形成和释放发挥作用，而未充分活化的中性粒细胞可能会抑制NETs形成，这样使得易感个体和物种的组织损伤加重.

1.3 血液组分

1.3.1 血小板 Thalin等［11］研究发现，在癌症相关脑梗死的患者中，患者的NETs明显升高，并且PMN前体、G⁃CSF、NETs的特异性标志物H3Cit在癌症患者中也有所升高，由此推测NETs可通过活化血小板及凝血因子发生促凝作用，从而促进动脉微小栓子的形成，导致癌症相关脑梗死的发生.Abdol等［12］研究显示，胰腺癌（PaCa）细胞可以刺激NETs快速释放，并且不需要依赖于ROS.他们还进一步评估了血小板在PaCa中诱导NETs的作用，并观察到PaCa激发的血小板能够使NETs释放增多.此外，NETs在静脉切断应激下促进血栓形成，即PaCa诱导的NETs很大可能使PaCa患者并发静脉血栓栓塞，并可将NETs视为潜在的治疗靶点.综上所述，血小板与NETs两者相互影响，共同在癌症的发生发展过程中起着一定的作用.

1.4 其他近几年医学界发现的其他一些蛋白质类和其他类物质及它们的促进或诱导机制如下：AgNPs（silver nanoparticles），一种新介质，可诱导被粘附的PMN释放NET［13］；肝氧蛋白A3直接诱导人类嗜中性粒细胞NET形成［14］；Cacciotto等［15］实验表明，独立的二棕榈酰基⁃S⁃甘油基⁃半胱氨酸脂肽序列能有效刺激NETs释放，表明对于由支原体脂蛋白介导的NET释放，重要的是脂质组分而不是蛋白质组分.另外还有侵袭素，b1整合素等许多物质诱导或促进着NETs形成，对疾病的发生发展有着潜在的影响.

2 抑制NETs形成的因素

2.1 蛋白质

2.1.1 新生儿NET抑制因子 存在于脐带血中的新生儿NET抑制因子（neonatal NET inhibitory factor，nNIF）是抑制NETs形成的关键终末事件.Yost等［16］研究表明nNIF可能是胎儿和新生儿炎症中NETs形成的重要调节剂.人类新生儿具有复杂而独特的易感性感染和炎性病理的免疫调节系统.研究发现从早产和妊娠期脐带血中分离出的PMN在被刺激时不会形成NETs，并且在NET介导的细菌杀伤中存在缺陷.现有研究应用活细胞成像进行定性评估NET形成与SYTO绿和SYTOX橙色DNA染色和通过上清液定量NET测量相关组蛋白H3，这些结果表明nNIF及相关分子是早产儿和新生儿期脐带血中NET形成的抑制剂［11］.还有实验共同证明了nNIF和CRISPP抑制NET形成并为它们在全身性无菌炎症感染的模型中具有有益效果提供了初步证据［17－19］.

2.1.2 中间普雷沃氏菌的核酸酶 已有研究表明，许多细菌病原体产生细胞外核酸酶来降解由PMN产生的NET支架DNA，使细菌逃避宿主的抗菌机制而导致其致病性增加.近年来，有报道证实许多牙周病致病菌能产生细胞外DNA核酸酶，能协助致病菌逃脱NET杀伤，从而增加毒力.但是，这些核酸酶的遗传多样性和功能作用在很大程度上是未知的［20－21］.Doke等［22］研究发现口腔周期致病性细菌产生两种核酸酶NucA和NucD，能使周期致病性细菌通过其核酸酶活性的机制逃避NETs先天防御，因此核酸酶活性可能是牙周细菌躲避抗菌机制并在牙龈上增生繁殖的过程中必不可少的.

2.1.3 磷脂酶D2 败血症是一种由入侵的感染微生物引起的全身性炎症反应综合征，目前并没有有效的疗法来改善患者的生存.败血症诱发的死亡率上升与宿主的吞噬和破坏入侵病原体的先天免疫缺失密切相关.磷脂酶D2（phospholipases D2，PLD2）是关键的细胞信号转导酶，能够水解磷脂酰胆碱生成磷脂酸和胆碱，还可以结合并激活许多不同的激酶、磷酸酶.核苷酸结合蛋白质和磷脂酶可以控制细胞迁移、增殖和活化.Lee等［23］使用PLD2/R/小鼠和PLD2特异性抑制剂的败血症小鼠模型确定PLD2在宿主防御中有高度致死功能.PLD2缺乏不仅可以提高生存率，而且能够减少实验性脓毒症期间的生命器官损伤.研究还表明PLD2在嗜中性粒细胞中是实验脓毒症发病机制和靶向PLD2药物的必要条件，这可证明其对脓毒症患者有益.

2.2 药物

2.2.1 南蛇藤醇 南蛇藤醇是中国草药学雷公藤F（TWHF）两种主要活性成分之一.实验证明南蛇藤醇能够下调促炎性细胞因子的表达，并调节许多炎症相关分子如JAK2，转录因子NF⁃κB，NADPH氧化酶，MHCⅡ等活性.不仅如此，它还可以抑制NET形成并下调SYK⁃MEK⁃ERK⁃NFκB信号串联，导致瓜氨酸化的组蛋白水平下调［24］.研究发现，南蛇藤醇能够抑制各种刺激诱导的SYK磷酸化，从而降低SYK活性，具有减弱后续通路的作用，使NETs形成减少［24］.由于SYK是作用在Raf⁃MEK⁃ERK上游的激酶，因此SYK（脾酪氨酸激酶）能作为南蛇藤醇作用新的分子靶位，使得南蛇藤醇有望成为治疗某些炎症疾病的有效药物.同时Yu等［24］也研究发现进行南蛇藤醇治疗时，其浓度超过10μM能增加细胞的死亡.对此，发展低毒性和高溶解度的南蛇藤醇派生物是解决这一临床使用障碍的方法.

2.2.2 Cl脒 Cl脒（Amidine）能通过阻止H3瓜氨酸化来抑制NET形成［25］.最近研究［26－27］表明，PAD4通过介导提高靶组蛋白H3，H4及H2A瓜氨酸化的核染色质解聚，在NET形成中起调节作用.PADs包括PAD4的抑制药物Cl脒通过共价修饰半胱氨酸活性位点不可逆地抑制PADs活性，进而抑制H3瓜氨酸化以减少NETs的形成.Knight等［28］也研究发现，使用PAD抑制剂治疗狼疮型小鼠，可以调节自身免疫反应并有效防止NET介导的血管损伤.

2.3 其他此外，还有许多物质有着抑制NETs形成的作用，如蛋白质类：前列腺素E2［29］，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）［30］，肽基精氨酸脱亚氨酶（peptidyl arginine de⁃iminase，PAD）［31］，真菌多糖半乳糖胺基半乳糖［32］，M1T1组链球菌胶原样蛋白1，蛋白酶体等，这些物质都有着各自影响NETs形成的机制，对疾病的发生发展有着重要的临床研究意义.

3 结语

众多研究已证实NETs具有强效的抗菌作用，并且参与多种疾病的发生发展过程，同时也对自身细胞和组织造成一定的损害.因此，探讨影响NETs形成的因素是极其重要的，对其进行合理的归类分析，能够更加清晰地了解各种因素与NETs之间错综复杂的联系，亦能为科研人员和临床工作者提供一些药物研究和疾病治疗的方向，从而有效地帮助各类疾病患者摆脱疾病困扰.

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Analysis on factors affecting the role of neutrophil extracellular traps（NETs）

LIANG Qiao-Mei1，MA Ren-Shu1，LI Chun-Mei1，SHEN Jia-Cheng1，LIANG Yan-Wen1，LIU Wei21Basic Medical College，Hebei Medical University，2Department of Immunology，Basic Medical College of Hebei Medical Universi⁃ty，Key Laboratory of Immune Mechanism and Intervention on Se⁃rious Disease，Shijiazhuang 050017，China

Neutrophil extracellular trapps（NETs）is a new type of immune defense mechanism，this paper intends to investigate the role of its influencing factors.Through Pubmed，Embase and other databases，we retrieved the latest literature，read the screenings，collected a variety of factors affecting the role of NETs，and summarized the factors affecting NETs.As a result，the factors affecting the role of NETs mainly include promotion，induction and suppression three aspects.In summary，many stud⁃ies have shown that the factors influencing the role of NETs are associated with the disease，and further studies can provide clini⁃cians with a treatment of the relevant diseases of NETs and a diag⁃nostic tool for assessing the prognosis of the disease.

neutrophil extracellular traps（NETs）；non⁃specific immunity；influencing factors

R392.1

A

2017－09－09；接受日期：2017－09－25

河北省科技计划项目（152777201）；河北省博士后科研项目择优资助项目（B2015003029）；河北省高等教育学会项目（GJXH2013－135）

梁俏美.本科.研究方向：肿瘤免疫.E⁃mail：597367486＠qq.com

刘 伟.博士.研究方向：肿瘤免疫.E⁃mail：liuweihebmu＠hebmu.edu.cn

2095⁃6894（2017）10⁃77⁃04