基因编辑技术在CHO工程细胞株改造中的应用研究进展

蔡俊立，胡泽斌，沈毅珺

基因编辑技术在CHO工程细胞株改造中的应用研究进展

蔡俊立，胡泽斌，沈毅珺

基因编辑技术是近几年迅速发展起来、可实现对基因组进行靶向精确修饰的一种生物技术，通过该技术可对基因进行定位突变、插入或敲除。从最初应用的锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）到转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effectors nucleases，TALENs），再到近两年愈加火热的 CRISPR/Cas9 系统，随着新基因编辑工具的不断发掘，对基因组进行定向改造的工作将变得更加高效精准、方便快捷[1]。

基因编辑工具可实现在基因组特定位点 DNA 双链断裂，随后，断裂的 DNA 双链将主要通过两种分子机制进行修复，机制 1：同源重组修复（HDR）即损伤的 DNA 使用同源 DNA 序列作为模板进行修复；机制 2：非同源末端连接修复机制（NHEJ）即非同源 DNA 片段断裂末端彼此连接[2-3]。目前基因编辑工具主要应用于对特定基因的敲除（knock out）/敲入（knock in），而对基因敲低（knock-down）的研究甚少[1]。

在现代生物制药产业中，哺乳动物细胞是最为常用的宿主细胞，尤其是中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO），常用于生产各种具有重要药用价值、并具有复杂翻译后修饰的蛋白，如治疗性单克隆抗体等[4-5]。目前，CHO 已成为各大跨国制药公司生产单克隆抗体药物的首选宿主细胞。但在药物研发过程中，如何得到高表达且产物质量稳定一致的工程细胞株是巨大挑战之一。而使用新型基因编辑工具可方便快捷地改造甚至设计出理想的工程细胞株用于商业化生产。以下将概述目前三大主流基因编辑工具（重点介绍 CRISPR/Cas9 技术）在 CHO 工程细胞株改造方面的应用进展。

1 ZFNs 技术

锌指核酸酶（ZFNs）是经过人工改造的核酸酶，它由锌指蛋白（ZFP）和 FokI 核酸内切酶构成，其中锌指蛋白来源于真核细胞转录子，可特异性识别基因组位点并与特定DNA 片段结合，而 FokI 是一种来源于 Flavobacterium okeanokoites 的核酸内切酶，负责在特定位点将 DNA 片段切割[6-7]。

1.1 快速筛选高表达 CHO 工程细胞株

ZFNs 技术已成功应用于 CHO 工程细胞株的定向改造。为了快速高效地筛选出高表达量细胞株，可通过 ZFNs技术敲除 CHO 细胞基因组内的谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因和二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）基因，Sigma Aldrich 公司已将这些经过改造的 CHO 细胞株（敲除 GS 或 DHFR）实现商业化[1]，且已有多家生物制药公司将该细胞株用于生物制品（如单克隆抗体）的研发和生产。

1.2 改造 CHO 工程细胞株以抵御鼠源性病毒污染

在 CHO 细胞培养过程中病毒污染是一种致命性的灾难，不仅给企业带来巨大的商业损失，若被污染的生物制品流入市场还会对患者用药安全性带来极大风险，即使在整个细胞培养环节中均使用无动物源性成分或化学成分限定（chemically-defined）原材料来生产，也不能完全规避 CHO细胞感染动物源性病毒，如小鼠细小病毒（murine minute virus，MMV）污染的风险。Merck 公司旗下 MilliporeSigma的科学家最近利用 ZFNs 技术开发了一款可以抵御 MMV病毒的 CHO 细胞株。MMV 病毒侵染 CHO 细胞主要依赖于其病毒衣壳与 CHO 细胞表面的特定多糖（糖链末端含有唾液酸）相结合，而 CHO 细胞基因组内 SLC35A1 基因表达的蛋白负责将唾液酸转运至高尔基体，并在高尔基体内完成该多糖链的组装。Mascarenhas 等[8]使用 ZFNs 基因编辑技术靶向敲除 SLC35A1 基因，从而使 CHO 细胞可免受 MMV 病毒的侵染。研究结果显示，当使用 MMV 病毒去侵染野生型和敲除 SLC35A1 基因后的 CHO 细胞时，野生型 CHO 细胞可迅速被侵染并造成细胞活力下降、增殖停止；而敲除 SLC35A1 基因后的 CHO 细胞却未被MMV 病毒侵染，细胞生长保持正常。更令人兴奋的是，当用该细胞系表达一种 IgG1 型抗体时，其表达能力和产物质量均未受 SLC35A1 基因敲除的影响。

2 TALENs 技术

转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）是继 ZFNs 后出现的第二代基因编辑技术，TALENs 是一种存在于植物（水稻等作物）病原体黄单胞菌中的转录激活样效应因子[9]，与 ZFNs 不同的是，TALENs 的 DNA 识别域识别特定单个核苷酸，因而可不受该核苷酸附近其他结构域的影响。在构建 TALENs 质粒时，需在靶位点编码区选择两处相邻的核苷酸序列来分别构建 DNA 识别模块，最后将它们融合至 FokI 的 N 端[2]，与 ZFNs 技术相比，该技术具有以下几方面优势：①核酸酶设计成功率更高；②靶向专一性更高；③靶向效率更高。据统计，使用 TALENs 技术进行 NHEJ基因敲除，效率可达 30%～100%，该技术已成功应用于模式生物，如大鼠的基因敲除[10]、构建抗病水稻[9]以及人类干细胞的基因修饰[11]等，但目前该技术用于 CHO 工程细胞株改造的案例并不多。Sakuma 等[12]曾使用 TALENs 技术将一段单链 Fv-Fc 基因成功靶向插入到 CHO 细胞基因组内。

3 CRISPR/Cas9 技术

CRISPR/Cas9 最初发现于一种细菌获得性免疫机制中，在该机制中 RNA 可引导 Cas 蛋白对入侵病毒或噬菌体 DNA 进行切割，使其无法在细菌内复制、扩增。后续研究发现该系统普遍存在于各细菌和古细菌中，目前来自Streptococcus p yogenes 的 CRISPR/Cas9 系统应用最为广泛[13]。

3.1 CRISPR/Cas9 系统机制概述

CRISPR/Cas9 系统主要包括由不连续重复序列（repeat）和长度类似的间区序列（spacers）间断排列而形成的 CRISPR 簇、前导序列（leader）和 Cas 蛋白组成，其中 Cas 一般位于 CRISPR 位点附近，它是一种 DNA 核酸内切酶，功能与 FokI 相似，在 gRNA 指引下可对特定基因片段进行精准靶向切割。对 CRISPR/Cas9 系统最主要的靶向要求是目的基因片段中要含有 PAM 序列，即 NGG。

使用 CRISPR/Cas9 技术进行目的基因敲除过程相当简便，首先，要寻找 NGG 序列附近 20 多个碱基与tracrRNA 序列融合，设计出 sgRNA 并合成该序列，将该序列和 Cas9 基因连入同一载体，经历转化感受态、序列验证、细胞转染以及敲除效果检测等过程，最终建立稳定敲除的细胞株。

目前 CRISPR/Cas9 技术已成功应用于细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物和鱼类等，以下将主要介绍使用该技术对CHO 工程细胞株的应用改造。

3.2 CRISPR/Cas9 技术用于加速 CHO 工程细胞株适应悬浮生长

使用悬浮生长的 CHO 细胞表达目的蛋白是当今生物制药产业中的主流，而在无血清培养基中，贴壁生长的CHO 细胞需经过多次驯化才能完全适应悬浮生长，Lee等[14]通过 CRISPR/Cas9 对 CHO 细胞基因组的定向改造，极大缩短了 CHO 细胞适应悬浮生长的时间。具体方法如下，通过利用链特异性 RNA-seq 策略获得了 CHO 细胞悬浮驯化过程中的转录组图谱，系统分析发现，在 CHO 细胞逐步适应悬浮生长过程中，Igfbp4 和 Aqp1 基因下调最为明显，使用 CRISPR/Cas9 技术靶向敲除 CHO-K1 细胞中这两个基因后，可显著加快该细胞适应悬浮培养进程，有助于进一步缩短生物药研发周期。

3.3 CRISPR/Cas9 技术用于 CHO 工程细胞株异源表达

在生物制药产业中，提高目的蛋白表达量也是现在面临的一大挑战。传统转染方法将目的基因插入到 CHO 细胞染色体组内的随机位点，目的基因融合在宿主细胞染色体的位置不同，将直接影响克隆生长、表达及表达产物的质量，因而该方法需通过后续大量药物加压筛选、亚克隆等工作，最终才能得到表达量较高的单克隆工程细胞株，而使用CRISPR/Cas9 技术即可实现目的基因定点插入至 CHO 细胞染色体组内。Lee 等[15]通过 CRISPR/Cas9 技术并借助于设计好的供体质粒（含有目的基因以及进行靶向位点融合的一小段同源序列）将约 3.7 kb 目的片段插入到 CHO 基因组特定位点，并最终成功获得稳定表达的细胞株。

雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mammalian target of rapamycin complex-1，mTORC1）可根据周围培养环境调节其生理代谢活动，研究表明增强 mTORC1 活力有助于提高细胞表达。McVey 等[16]使用 CRISPR/Cas9 技术靶向敲除CHO 细胞中抑制 mTORC1 活性的 TSC2 基因，敲除后的CHO 细胞株在补料批培养条件下 mTORC1 活力显著提升。表型上，细胞直径变大，单细胞表达量提高两倍以上，且 TSC2 的敲除并未影响分泌抗体的质量。

CRISPR/Cas9 技术为提高 CHO 细胞目的蛋白表达、降低生产成本提供了又一新思路。未来随着对 CHO 基因组更加深入的了解，可通过 CRISPR/Cas9 技术将目的基因定向融合至 CHO 基因组转录活跃区域，更加快速、高效地获得高产量工程细胞株。

3.4 CRISPR/Cas9 技术用于 CHO 工程细胞株表达产物质量改造

CRISPR/Cas9 技术已开始用于单克隆抗体关键质量属性的改造。抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）是某些抗癌类单克隆抗体发挥药效的重要作用机制，大量研究表明，抗体重链 N-糖链中缺少核心岩藻糖分子会显著增强其ADCC 效应，进而极大提升药效。Louie 等[17]通过CRISPR/Cas9 技术定向敲除 CHO 宿主细胞中 FUT8基因（编码一种 α1,6 岩藻糖基转移酶），成功获得了表达无岩藻糖基化单克隆抗体的工程细胞株，且该基因的敲除未影响细胞表达量和产物其他关键质量属性。Sun 等[18]也通过CRISPR/Cas9 技术对一种 anti-CD20 单克隆抗体进行去岩藻糖基化改造，同样得到了非常理想的结果。

4 前景展望

基因编辑技术，尤其是 CRISPR/Cas9 将成为 CHO 细胞株工程改造最强有力的工具之一，但要实现该目标，在以下两个方面仍需继续进行探索。其一，目前 CRISPR/Cas9技术仍需不断进行改进。在哺乳动物细胞中，由于细胞类型及靶位点的不同，使用 CRISPR/Cas9 技术进行基因改造时靶向效率有着很大差异（2.3%～79%），同时该技术还可能造成不同程度的脱靶突变，通过理性设计高活力 gRNAs 或改造 Cas9 蛋白可一定程度上解决上述问题。其二，需增加对哺乳动物细胞，尤其是 CHO 细胞全基因组、代谢通路的理解。目的基因插入 CHO 细胞基因组位点将直接影响细胞生长和表达，探究转录活性位点位置将有助于快速得到高表达工程细胞株；此外，表达产物关键质量属性与多种关键代谢途径有关，通过改造决定这些代谢通路的基因可最终获得理想质量的目的蛋白[19]。

目前国内外使用 CHO 细胞生产的生物制品越来越多，质量源于设计（quality by design，QbD）的理念也逐渐深入人心，随着基因编辑工具不断改进以及新工具的出现，改造原有工程细胞株，甚至定制设计全新细胞株将变得更加高效快捷，在极大缩短生物制品开发周期的同时，还能生产出安全性更高、质优价廉的生物药造福于全人类。

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201210 上海复旦张江生物医药股份有限公司（蔡俊立、沈毅珺）；100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所（胡泽斌）

沈毅珺，Email：yjshen@fd-zj.com；胡泽斌，Email：huzbcmba@163.com

2017-01-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.013