高通量测序技术在苎麻生物学研究中的应用

易浪波，李富，崔国贤

（1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000；2.湖南农业大学，长沙410128）

高通量测序技术在苎麻生物学研究中的应用

易浪波1，李富1，崔国贤2

（1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000；2.湖南农业大学，长沙410128）

近10年来以高通量为特征的第二代测序技术迅猛发展，并被广泛应用到医学，生命科学及农业等领域。新一代测序技术具有成本低、效率高等特点，使得许多非模式生物的基因组和转录组从头测序成为可能。苎麻作为我国传统的天然纤维作物，其种植面积和产量占全世界的90%以上。解析其性状的形成发育机制对于苎麻的分子改良非常重要。近几年来，为了阐明苎麻性状的生物学机制，国内外多个团队以转录组研究为切入点，通过高通量测序技术对苎麻生物学研究开展了大量的研究。本文从高通量测序技术、苎麻转录组研究进展、苎麻重要性状基因识别、苎麻进化驯化机制研究及分子标记的开发利用等几个方面进行了综述，将为挖掘苎麻重要性状基因提供理论基础、为苎麻分子标记辅助选择提供了大量的可靠标记，高通量测序已经推动苎麻性状生物学研究的快速发展，也将为苎麻的分子育种研究奠定基础。

高通量测序；苎麻；转录组；基因表达；SSR标记；QTL

引言

DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。近十年来，第二代测序出现并快速发展，催生了生物组学这一新兴学科。第二代测序技术最显著的特征是一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，其主要测序平台包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台［1］。第二代测序技术已经被广泛用于生物学研究，包括基因组测序，转录组分析，小RNA和长链非编码RNA测序，基因组甲基化分析等。近年来，基于第二代测序技术，许多非模式生物的转录组和基因组得到分析，如板栗、珊瑚幼虫、甘薯、人参根、鹰嘴豆和海带等［2－6］。苎麻（Boehmeria niveaL.）作为我国特色的天然纤维作物，拥有悠久的种植历史和成熟的栽培技术，其种植面积和产量占全世界的90%以上，仅次于棉花。从苎麻韧皮提取的纤维不仅可做重要的纺织工业原料，还具有重要的饲用功能。由于苎麻具有营养生长迅速、根系发达和无二次污染等特点，还作为一种修复作物被广泛应用于镉污染农田地的处理。随着高通量测序技术的发展，苎麻转录组得到广泛研究。例如，加深对苎麻生长发育相关机制的了解；苎麻韧皮部纤维形成和发展相关基因的识别；构建虫、旱和镉三大逆境转录组表达谱及相关基因挖掘；还有构建遗传标记图谱并识别相关QTL等等。这些研究加速了苎麻分子育种，为培育高品质的苎麻纤维品种提供理论依据。

1 高通量测序技术介绍

在测序技术发展历程中，高通量测序技术堪称一个新的里程碑，该技术可以同时对数百万个DNA分子进行测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行深入细致的分析成为可能，因此高通量测序技术也称为深度测序（deep sequencing）［7］或下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）［8］。目前，高通量测序技术主要是指罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台组成的第二代测序技术以及HelicosHeliscopeTM、Oxford Nanopore和Pacific Biosciences推出的第三代单分子测序技术。

第二代测序技术开始于2005年454 Life Sciences公司（现已被Roche公司收购）首先推出的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统。此后，Illumina公司（2006）和ABI（2007）公司相继推出了Solexa和SOLiD（supported oligo ligation detetion）测序技术。它们与焦磷酸测序法的原理类似，核心思想都是边合成边测序，即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光；要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号［9］。与此同时进行荧光标记的成像检测，从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计算机分析获得完整的DNA序列信息。第二代测序技术避免了电泳过程，且高通量数据基于芯片分析，从而大大节省时间和成本。罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台各有优缺点。454测序技术具备更长的读长，它的平均读长在700－1000 bp左右，最高达1 kp。因此，454平台比较适合对未知基因组从头测序，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高，且价格比其他技术高很多。Solexa测序技术拥有较低的成本和高性价比优点。它的低样品需求，简单的流程，高质量的数据以及应用灵活性使它从几大测序技术中脱颖而出。SOLiD测序读长较短，但具有更高精度，适合用于SNP检测等。

2 苎麻的转录组研究

高通量测序技术的发展，使非模式生物的转录组和基因组获得成为可能。苎麻作为一种重要的天然纤维作物，了解其韧皮部纤维生长发育的分子机制具有重要的研究价值。Liu等率先开展了苎麻转录组测序，用Illumina测序获得43990条基因表达序列，其中34192（77.7%）条基因序列被注释了功能［10］。

Chen等运用454公司的GS FLX测序平台对苎麻韧皮部不同生长阶段的转录组进行了测序，获得了58396条基因［11］。基因功能注释显示苎麻和葡萄亲缘关系最近，有32.05%的基因显著同源。另外，分析四个生长阶段的基因表达水平，共筛选到780个差异表达基因，其中13个基因在韧皮部顶端组织中特异高表达，它们分布于3个基因家族，分别是4个纤维素合成酶家族，3个扩张蛋白基因家族及6个木葡聚糖内糖基转移酶／水解酶家族，推测它们可能与苎麻纤维形成相关。苎麻转录组的测序和相关基因的发现，有助于进一步理解苎麻纤维发育形成的分子机制，为培育高品质苎麻提供理论依据。

3 苎麻重要基因识别

3.1 全基因组表达谱识别逆境应答基因

干旱是影响苎麻生产的主要环境因素。旱逆境下的苎麻株型矮小，纤维产量显著降低。为此，Liu等系统的研究旱逆境苎麻的形态，生理及基因表达特征［12，13］。通过生理学研究，他们发现旱胁迫苎麻体内的活性氧含量升高，各种抗氧化酶活性显著增强，丙二醛等生理指标也发生明显变化，而当施加外源赤霉素则可以改善苎麻的耐旱性［12］。利用Illumina测序，Liu等首次开展了旱胁迫苎麻的全基因组表达谱分析，共识别1516个旱逆境应答基因，其中24个为转录因子编码基因［13］。qRT－PCR进一步证实了其中12个旱逆境应答的转录因子编码基因表达受旱逆境调控。在这12个转录因子基因中，其中一个基因为DELLA蛋白编码基因，其能降解赤霉素。由于赤霉素是促进植物生长重要激素，该团队提出赤霉素代谢相关基因的表达变化是导致逆境苎麻的重要原因。之后，An等也用聚乙二醇（PEG）处理苎麻根和叶，以模拟苎麻的干旱胁迫，并开展Illumina测序，共识别到25个旱逆境相关的转录因子编码基因［14］。除了挖掘苎麻自身逆境应答因子，An［15］等还通过导入外源耐旱基因以改良苎麻耐旱性。An等将水稻SNAC1基因成功转化到苎麻中，使得转基因植株耐旱和耐盐能力得到显著提高［15］。

根腐线虫（Pratylenchuscoffeae）则是导致苎麻减产的主要病害，了解苎麻对害虫的分子防御机制有利于提高苎麻的抗病性。Zhu等率先开展了根腐线虫害苎麻的转录组谱研究，共识别777个受此病害调控表达的基因，并发现苯丙氨酸代谢、类胡萝卜素生物合成和苯丙素生物合成等三个代谢途径显著受到了此病害的影响［16］。另外，Yu等利用根腐线虫高抗和易感品种分别开展了虫害逆境下的苎麻转录组谱研究，但仅仅137个虫害逆境应答基因被识别，且发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂可能在线虫抗性中发挥重要作用［17］。苎麻夜蛾是一种重要的经济作物害虫，对苎麻生产也具有一定的影响。Zeng等对夜蛾感染的苎麻进行了转录组分析，对感染和未感染苎麻叶进行测序和转录组比较，共发现了750个上调表达和1230个下调表达基因［18］。

我国南方地区土壤重金属污染严重，其中镉是最主要的污染源。苎麻具有生长快、生物产量大、抗逆性好、镉金属富集能力强等特点，被认为是理想的镉污染土壤修复作物。但当土壤镉含量达到一定浓度时，其生长仍然被抑制，相应的分子机制尚不清楚。因此，Liu等开展了镉胁迫苎麻的转录组谱研究，在镉胁迫苎麻和对照苎麻间共筛选到155个差异表达基因，并发现2个GA2氧化酶基因在镉逆境苎麻中表达水平显著上调［19］。由于GA2氧化酶能够将活性赤霉素转化成非活性状态，因此他们推测GA2氧化酶基因的上调表达可能与镉逆境苎麻株型矮小相关。另外，She等也利用Soleax测序构建了镉胁迫和对照苎麻的根系基因表达谱，共筛选到3887个差异化表达基因［20］。

综上所述，根腐线虫害、干旱和镉逆境是苎麻生产的主要生物和非生物逆境，能显著抑制苎麻生长，导致作物株型矮小、纤维产量降低。为此，Liu及其团队系统研究了逆境苎麻的形态、生理特征，率先完成了这些逆境下苎麻的全基因组表达谱分析，并提出旱、镉逆境苎麻株型矮小的分子机制。这些研究成果极大的丰富了我们对苎麻的逆境应答及耐受机制的认识，而大量逆境相关基因的识别也为苎麻的抗逆分子育种提供了基因资源。由于该团队在逆境苎麻生物学研究领域的重要突破，他们的研究也成功带动了国内外其它团队在此领域的相关研究。

3.2 性状相关基因或小RNA的识别

苎麻是重要的天然纤维作物，纤维发育相关基因的挖掘将为解析该性状的形成和发育机制提供基础。纤维素合成酶是植物纤维合成的关键酶，基于转录组序列，Liu等在苎麻中共识别了51个纤维素合酶基因，其中36个可能与其韧皮纤维发育相关［10］。Chen等构建了韧皮部不同发育阶段的基因表达谱，发现780个差异表达基因，其中13个为纤维素合成酶家族基因［11］。NAC蛋白是植物特有的转录因子，对植物的纤维发育具有重要的调控作用。Liu等共识别了32个苎麻NAC基因，并发现其中5个与模式植物中调控纤维发育的NAC蛋白高度同源，推测它们也可能参与苎麻的纤维发育调控［21］。Chen等构建了苎麻韧皮部和木质部的转录组谱，发现Pol II和Pol III亚基及半乳糖代谢途径基因在韧皮部高表达，表明高活性的RNA合成和半乳糖代谢途径可能保证韧皮部纤维的合成［22］。此外，小RNA也可能参与了苎麻的韧皮纤维发育调控。Wang等构建了苎麻纤维伸长、胞壁增厚和端壁溶解阶段小RNA表达谱，并在纤维伸长增厚和端壁溶解阶段分别识别了150和148个小RNA，推测他们可能也与苎麻的纤维发育相关［23］。

转录因子对于调控植物的逆境抗性具有重要的作用。基于转录组序列，大量苎麻转录因子编码基因也得以发现。Liu等在苎麻中共发现了32个全长的NAC蛋白编码基因，其中24、2和1个NAC基因分别在茎木质部、叶和花呈现高表达，并且有14、11和4个NAC基因分别受旱、镉和根腐线虫害逆境应答调控［23］。Zheng等对苎麻在根腐线虫害、旱和镉三大逆境下的转录因子基因进行研究分析，发现了MYB，AP2／ERF，bZIP，COL和HD－ZIP等6个家族的179个基因中，96个基因的表达能受其中一种逆境调控，而54个基因的表达则能受到两种逆境同时调控［24］。

COL家族是一个与拟南芥CONSTANS（CO）蛋白相类似的锌指类蛋白转录因子家族，该家族中多个家族参与了植物的开花调控。Liu等从苎麻转录组中识别了6个COL基因，其中BnCOL2蛋白与CO蛋白高度同源［25］。亚细胞定位证实了BnCOL2蛋白主要在细胞核中发挥作用。而且光周期实验表明，在长日照和短日照条件下BnCOL2基因的表达均呈现昼夜节律，且在长、短日照条件下，其呈现不同的节律性表达变化。据此推测，BnCOL2可能与CO功能类似，是控制苎麻开花性状的侯选基因［25］。

谷氨酰胺合成酶在高等植物中参与氮代谢，调节植物的生长发育。Zheng等首次发现了3个苎麻谷氨酰胺合酶家族基因（BnGS），通过表达模式分析显示BnGS1－1和BnGS2在叶生长过程相对富集表达，说明它们在N摄取吸收中有重要作用［26］。BnGS1－2在韧皮部和木质部高表达，暗示可能与纤维的形成发展有关。BnGS基因的识别有利于进一步了解苎麻的饲用特性。

SAUR基因是生长素早期应答基因。Huang等首先在荨麻科植物中识别到62个桑树SAUR基因、56个大麻SAUR基因和71个苎麻SAUR基因［27］。随机选取15个苎麻SAUR基因进行表达分析显示，SAUR基因在苎麻的生长素生长调控，干旱和高温逆境应答调控等多个生物学过程中具有功能［27］。

4 苎麻进化驯化机制研究

苎麻在我国已经有4700余年的栽培历史，但其确切进化驯化机制还不清楚。为此，Liu等开展了比较转录组研究以揭示其进化选择模式［28］。对野生青叶苎麻和栽培种苎麻中苎1号进行转录组测序，分别获得59246和56932条表达基因序列。两转录组序列比较分析发现，两种间共识别到10745个直系同源基因，其中85个基因受到负向选择，13个基因受到正向选择。这98个基因大多数与抗病性和非生物逆境有关，说明生物和非生物胁迫是驯化的主要因素。另外，研究中还发现两个与苎麻纤维产量相关基因呈现快速进化，这很可能是人类祖先驯化选择的结果。可见，野生苎麻向栽培种进化是在自然环境和人工选择的双重选择压力下进行的［28］。

5 分子标记开发和应用

苎麻的主要农艺性状都属于复杂的数量性状，在后代中呈现连续的表型变异，其遗传基础难以界定。随着分子标记的出现，使数量性状基因位点（QTL）的遗传定位成为可能。SSR标记具有多态性好，基因组位置易于检测等优点，已被广泛用于作物的遗传图谱构建，种质资源鉴定，分子育种等［29］。但一直以来，苎麻中可用的SSR分子标记非常匮乏，严重的阻碍了苎麻的遗传及育种研究。为此，Liu等利用转录组序列大规模开发了苎麻的SSR标记，使得苎麻中可用的SSR标记由之前的不足100个增加到1827个［29］。这些标记的开发为苎麻的遗传及分子育种研究提供了坚实的分子标记基础。之后，Chen等也利用苎麻纤维转录组序列开发了苎麻SSR标记，使得标记数目进一步增加到4230个［30］。

为了开展苎麻农艺性状的遗传分析，Liu等利用扦插繁殖技术构建了苎麻F2无性分离群体。基于此群体，该团队绘制了苎麻首张SSR标记遗传图谱，并对纤维产量等性状进行QTL定位分析，共发现了33个纤维产量相关QTL［31］。苎麻是高度杂合的物种，自交会导致纤维产量等性状的衰退，甚至植株的死亡，因此，苎麻性状具有杂种优势。通过对纤维产量相关性状进行遗传分析，该团队发现大量纤维产量相关的QTL具有超显性效应，从而他们提出大量超显性QTL的存在是苎麻产量相关性状杂种优势的遗传基础［31］。此外，Liu等也对4个开花相关的性状进行了QTL分析，共检测到29个QTL［32］。可见，Liu及其团队在苎麻的数量遗传学研究方面已取得了好的突破，他们率先绘制了苎麻的分子标记遗传图谱，并完成了多个农艺性状的QTL定位。由于大量QTL的识别能为苎麻的分子标记辅助选择育种提供了目标位点，他们的研究也极大的推动了苎麻分子育种的发展。

6 问题与展望

苎麻是我国特色的天然纤维作物，在我国已有数千年的栽培历史。近年来苎麻饲用功能的开发，进一步突显了该作物的重要性。然而，受制于苎麻遗传和分子生物学学科的发展，苎麻的分子育种工作一直未起步。近10年来，高通量测序技术快速发展，并应用于苎麻的遗传和生物学研究中，使得苎麻遗传和分子生物学学科快速发展，这为发展苎麻的分子育种提供新的契机。但是，高通量测序技术在推动苎麻生物学研究中的作用还没有完全释放，在推动苎麻生物学研究及分子育种研究，仍还有许多工作需要开展，其主要表现在以下两个方面。

（1）苎麻基因组特征仍未阐明。一般来讲，基因组测序的完成及序列的释放，将能极大的推动物种的遗传，分子生物学和分子育种工作的开展。但是，目前的苎麻的基因组研究还没有完成，很大程度上限制苎麻生物学的研究。

（2）苎麻生物组学研究仍然没有起步。变异组学和野生种泛基因组研究将能够广泛的挖掘作物的优异基因资源，以推动作物性状生物学机制研究。目前，高通量序列分析技术使得水稻，大豆，黄瓜等主要作物都相继完成了相关的研究，但苎麻中相关的研究仍然没有开展。

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App lication of High－throughput Sequencing Technology in the Research of Ram ie（Boehmerianivea L．Gaud）Biology

YILangbo1，LIFu1，CUIGuoxian2
（1.College of Biology and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China；2.Hunan Agricultural University，Changsha，410128，China）

In the past ten years，the high－throughput next－generation sequencing（NGS）technology appeared and developed rapidly，and itwaswidely applied inmedicine，life sciences，agriculture and so on.The NGS technology shows several advantages than traditional Sanger sequence，such as low－costand high efficiency，whichmade thede novoassembly of genome and transcricptome become feasible in non－model species.Ramie is an important natural fiber crop in China，and both its fiber yield and plant acreage in China accounted for 90%of the global yield and acreage.It is of crucial importance to analyze its formationmechanism of traits formolecular improvement.In recent years，domestic and international scientists carried a great deal of studies for the ramie biology based on the transcriptome analysis by high－throughput NGS technology in order to understand the biologicalmechanism of traits.In conclusion，the NGS technology has not only greatly promoted the development of trait biology，but also provided a basis formolecular breeding in ramie.

high－throughput next－generation sequencing technology；ramie；transcriptome；gene expression；SSR marker；QTL

S563.1

A

1671－3532（2017）02－0088－06

2017－01－17

易浪波（1980－），女，湖南涟源人，硕士，高级实验师，主要从事植物学研究。E－mail：26063568＠qq.com

*通讯作者：崔国贤（1963－），男，教授，博士／博士生导师，从事苎麻栽培和遗传育种研究。E－mail：gx－cui＠163.com