基因表达评分在非糖尿病冠心病诊断中的应用进展

张亮，张健

· 综述 ·

基因表达评分在非糖尿病冠心病诊断中的应用进展

张亮1，张健1

现有的冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）诊断手段主要有心电图、心脏超声、冠状动脉造影、冠状动脉CTA及心肌灌注成像（MPI）等，其中冠状动脉造影是诊断冠心病的金标准，临床中在冠状动脉造影检查前通常使用非侵入性检查手段进行危险因素评估，但均存在特异性差或敏感度低等缺陷，不利于冠心病的早期诊断。

基因表达评分（GES）是基于患者年龄、性别以及通过qRT-PCR的方法定量检测患者外周血中23个基因表达水平使用特定公式（表1）进行计算从而得出相应评分，其用于非糖尿病患者冠心病检测已被多中心研究证实。

1 基础研究

1.1 研究背景 冠心病及其并发症，如急性心肌梗死、心力衰竭，具有极高的致死率和致残率。在当今心脏病学实践中，治疗指南[1]建议对于中危患者推荐无创性影像检查，对于高危患者推荐行冠状动脉造影。然而在实际临床工作中，对于可疑胸痛患者的危险分层缺少明确指征，且无创性影像检查仅能筛查出不到40%的冠心病患者[2,3]。另外在女性可疑胸痛患者中，使用如心电图、心脏超声等无创性检查并不能很好的排除非冠心病患者[4]，因此一种无创准确的冠心病早期检测手段在冠心病诊疗中显得更为迫切需要，COURAGE（Clinical Trials Utilizing Revascularization and Aggressive Drug Evaluation）研究[5]也推荐尽量使用创伤性较小的诊断手段来确诊疾病。外周血的基因表达变化非常灵敏的反应冠心病的发生发展状态[6]，目前已有研究[7,8]表明，定量测定外周血中相关基因的表达量可反应冠心病的严重程度，因此通过非侵入性的血液检查，可以可靠的评估冠心病的发病风险。

1.2 基因选择 冠心病的主要发病因素是冠状动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化的发生发展与炎症密切相关[9]。一些炎症细胞与因子聚集在损伤的内皮周围，促使动脉粥样硬化的形成和易损斑块的破裂。由于血液循环，动脉粥样硬化的先天性免疫应答和适应性相关的循环血细胞包括嗜中粒细胞，NK细胞，B、T淋巴细胞特异性表达相关的基因间接的表现在外周血中，如CASP5[10]在脂核进展的过程中表达水平明显上调；KLRC4[11]通过激活NK细胞进而减少动脉粥样硬化过程中淋巴细胞计数。

DUKE大学CATHGEN实验室展开一项研究，共纳入195例患者，经过微阵列分析筛选出2438个冠心病相关基因，进行相关性分析后选出88个基因用于RT-PCR，分别对非糖尿病和糖尿病患者进行冠心病相关基因表达量分析（其中非糖尿病患者124例，糖尿病患者71例），阳性组判定标准：在一个主要的器官中有一处最大狭窄≥75%，或有两处≥50%为病例组，对照组为所有主要血管中＜25%狭窄。最终在非糖尿病人群与糖尿病人群中分别确定42和12个显著相关的基因（P＜0.05）且两者之间没有重叠基因，所以后续临床研究只针对非糖尿病患者。PREDICT（Personalized Risk Evaluation and Diagnosis in the Coronary Tree）研究【http://www.clinicaltrials.gov, NCT00500617】中纳入198例非糖尿病冠心病患者，经过微阵列分析筛选出5935个冠心病相关基因，通过生物相关性分析数据特异、生物相关性以及RT-PCR后基因表达水平测定共筛选出113个冠心病基因。选择PREDICT组[12]中640例非糖尿病样本（病例组/对照组：210/430），用RT-PCR分析这113个基因，从而进行算法开发。用LASSO分析基因表达的相关性，将基因进行分类，用岭回归分析（Ridge Regression），基于基因表达相关聚类和细胞类型分析，最终确定与冠心病相关的类群，包括性别、年龄以及6个基因组23个基因，包括20个冠心病相关基因及3个管家校准基因。

1.3 基因评分系统 以基因表达评分系统为基础的Corus CAD算法包含患者年龄、性别以及全血中6个基因组共23个基因，它提供一个1-40的评分，其阴性预测值达95%；评分≤15分的患者冠状动脉狭窄程度≤25%，且1年内的血运重建及不良事件的发生率极低，基因表达评分与心血管事件及血运重建具有明显的相关性[13]。随着分数增高，其冠状动脉狭窄程度越高，该评分可以预测冠心病发病风险。在一项前瞻性实验中[14]，使用该算法用ROC分析交叉验证估计AUC=0.70（95%CI：0.65～0.75），在临床中具有较好的应用价值。另外，基因表达评分在女性人群中的应用表现尤其出色[15]。

1.4 实验影响因素 一项实验[16]通过全血质控品来考察批内变异及批间变异情况，包括人员，仪器，试剂在内一共分析11个影响因素。批内和批间变异性分别是0.092和0.059，总体变异性是0.11。将11个影响因素进行回归分析发现，检测板和cDNA试剂盒是主要的影响因素。总体上看，RNA提取试剂盒，cDNA合成以及qRT-PCR贡献了大部分批间变异（52.3%），其次是操作和仪器（18.9%，9.2%），其余19.6%未知。批间变异中的PCR过程在总体变异中贡献最大，试剂批次是批内变异中的主要因素。

2 临床研究

2.1 GES优于核素心肌灌注显像（MPI） COMPASS（Coronary Obstruction Detection by Molecular Personalized Gene Expression）[17]研究是一项多中心的前瞻性试验，共纳入537例非糖尿病患者，将入选者外周血样本用于GES检测，之后这些患者又接受了MPI检测。对于MPI检测异常的患者接受冠状动脉造影或者冠状动脉CTA。最终431例患者完成了GES、MPI和冠状动脉成像（冠状动脉造影或CT血管成像）。患者平均年龄56±10岁（48%为女性）。预先设定终点是GES受试者操作特性分析确定的＞50%狭窄。GES受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.79，灵敏度，特异性及阴性预测值分别为89%、52%和96%，对应的阈值为＜15分，患者占比46%。通过受试者操作特性以及再分类分析GES优于其它临床因子，并与最大动脉狭窄程度呈高度相关关系。对患者进行6个月的随访显示，GES＞15的患者中，有97%的患者，即28名患者中有27例出现不良心血管事件或接受血管重建。GES在冠心病的检测中有高灵敏度和高阴性预测值。在这项临床实验中，GES优于其它临床因子和MPI。

2.2 GES与冠状动脉狭窄程度及斑块负荷高度相关 为寻求确定GES与通过CT血管成像检测得到的患者冠状动脉狭窄之间的相关性。在一项前瞻性实验中[18]，研究者对526例非糖尿病患者分别进行冠状动脉CT检查和GES检测，结果得出基因评分与冠状动脉狭窄程度呈正相线性关系。另外一项研究[19]分析了PREDICT和COMPASS研究中来源于59个中心的610例患者（平均年龄57±11岁；50%为男性），这些患者进行冠状动脉CTA得到狭窄程度以及GES评分。根据冠状动脉狭窄程度将冠状动脉CTA结果分为5级，0：无狭窄，①极小狭窄，②轻微狭窄，③中等狭窄，④严重狭窄，⑤堵塞。通过单因素方差（ANOVA）以及受试者工作特征曲线（ROC）进行相关性分析。结果发现GES与CTA评分（r=0.37；P＜0.001）高度相关。通过方差分析，随着GES值升高，冠状动脉狭窄程度也不断增加（P＜0.001）；GES与最大冠状动脉狭窄（r=0.41；P＜0.01）及狭窄评分指数（r=0.38，P＜0.01）高度相关，GES低值（＜15）灵敏度为0.90，GES高值（＞28）特异性为0.87。GES与通过CT血管成像检测得到的患者动脉粥样硬化斑块和狭窄之间高度相关。一项基于ATLANTA（Assessment of Tissus characteristics,Lesion morphology and hemodynamics by Angiography with fraction flow reserve,intravascular ultrasound and virtual histology and Non-invasive computed Tomography in Atherosclerotic plaques）研究结果的临床试验[20]，通过使用IVUS/VH测量冠状动脉斑块负荷（包括纤维组织、坏死脂核、钙质密度），用斯皮尔曼等级相关关系处理测量结果与基因表达评分的关系。试验共纳入18例患者，平均年龄61.1±8.6岁，67%为男性，平均GES21.6±9.4分，经过斯皮尔曼等级相关处理后认为GES不仅仅与冠心病相关，而且与斑块负荷有关，其钙化程度越高、斑块体积越大，相应GES越高。

2.3 基因表达评分稳定性 稳定性是检测分子生物诊断手段是否可靠的重要指标。一项[21]研究使用受试者操作特性曲线（ROC）分析来源于PREDICT研究中样本中基因表达评分，研究者重新检测了保存5年的PREDICT研究中验证样本队列（n=526），基因表达评分平均值从5年前的20.3分变为5年后的19.8分（n=501），另外将173例约1年前入组的COMPASS研究患者样本用于GES检测，基因表达评分平均值有微小的上升，从15.9分～17.3分，相对应的冠心病风险上升2.5%，表明血液中的基因表达并不会随时间而发生量的明显改变，其中一些微小的变化考虑是由于心血管药物的使用所导致。

3 GES在临床中的应用

3.1 使用GES诊断冠心病 IMPACT-PCP（Investigation of a Molecular Personalized Coronary Gene Expression Test on Primary Care Practice Pattern）研究[22]是一项评估Corus CAD评分在医师对于首次就诊的阻塞性冠心病患者中的诊断策略的影响。在4个初级护理机构中用基因表达评分（GES）诊断稳定的、非急性的、非糖尿病并伴有胸痛和相关症状的患者。所有接受GES检测的患者，记录他们在GES之前和之后的诊断策略。GES是通过外周血中23个基因表达水平的计算对冠心病进行诊断，阴性预测值为96%。结果证实在251例受试者中，140例女性（56%）；平均年龄56岁（标准差13.0），平均体质指数30 mg/kg2（标准差6.7）。平均GES为16（范围1～38），127例患者（51%）低GES。251例中有145例患者在GES后改变了诊断方案，在对247例（98%）患者为期30 d的随访中，仅有1例MACE事件（低GES评分患者发生出血性卒中）报道。由此认为将GES整合入冠心病的诊断流程中显示出临床实用性，可以优化患者的诊断评估。

3.2 使用GES预测MACE 临床中已经证实血液GES可用于冠心病的预测，然而对于那些接受冠状动脉造影的患者，GES是否同样能够预测其主要心血管不良事件及血运重建情况从而对治疗进行相关指导。一项基于PREDICT 研究结果的临床试验[23]，共纳入1160例患者，通过随访造影及基因表达评分，评估其在1年内MACE（主要心血管不良事件）和血管重建情况，研究结束时共1116例完成随访，其30 d不良事件率为23%，12个月不良事件率增加2.2%。GES与MACE/血管重建率相关，GES大于15的患者，＞30 d MACE/血管重建的风险增加，MACE总发生率为1.5%（17/1116），17例中3例GES≤15。全部低GES组（n=396），MACE/血管重建阴性预测值为90%。由此推测基因表达评分在临床中可筛选出无阻塞性冠心病以及1年内发生MACE可能性低的患者。

3.3 使用GES指导医师避免过度检查 IMPACT-CARD（Investigation of a Molecular Personalized Coronary Gene Expression Test on Cardiology Practice Pattern）研究[24]是一项前瞻性临床试验，为了评估GES是否影响心脏科医师在冠心病患者临床诊断中的决策。该项研究共纳入83例稳定性冠心病患者，分别由6位心脏科医师根据临床因素及患者症状作出临床决策，包括侵入性检查或无创性检查，然后根据GES结果重新作出最终决策。结果发现，有48例患者[58%，95%CI（46%，69%）]的诊疗意见发生变动，更多的患者接受了少量的、无创检查，在这部分人群中高达91%的患者GES≤15分。而对于那些检查项目增多的患者，其GES均有不同程度的升高。在这项研究中，结果表明在临床实践中可以通过基因表达评分来指导低危患者避免接受过度的医疗检查的方法是有效可行的。

4 展望与不足

GES可有效的评估冠心病风险，可以预测冠状动脉狭窄程度、斑块负荷，在冠心病的检测中具有高灵敏度和高阴性预测值，优于其它临床因子和MPI。目前以GES为代表的项目Corus@CAD检测已在美国50个州，印度，以色列等地获得了检测许可，并被美国安泰保险和考文垂的健康保险纳入医疗保险覆盖范围。近来，国外越来越多的科研团体展开对GES在疾病中的应用，美国心脏病协会亦发表临床策略声明[25]讨论在未来临床中基因如何在心脏疾病的诊断与治疗中发挥作用，亦代表了当今医疗的大趋势。

GES作为一项新型的检测手段，在应用初期仍存在诸多不足，对于糖尿病人群、合并全身反应综合征、系统性感染、服用类固醇药物或化疗药物的人群，会干扰GES的准确性。且目前国外研究所纳入的人群多为白种人，对于亚洲人群，其研究结果需要进一步验证。

[1] Fihn SD,Gardin JM,Abrams J,et al. ACCF/AHA/ASE/ASNC/HFSA/ HRS/SCAI/SCCT/SCMR/STS 2013 Multimodality Appropriate Use Criteria for the Detection and Risk Assessment of Stable Ischemic Heart Disease [J].J Am Coll Cardiol,2012,60(24):e44-e164.

[2] Patel MR,Peterson ED,Dal D,et al. Low diagnostic yield of elective coronary angiography[J]. N Engl J Med,2010,362(10):886-95.

[3] Rozanski A,Gransar H,Hayes SW,et al. Temporal trends in the frequency of inducible myocardial ischemia during cardiac stress testing:1991-2009[J]. J Am Coll Cardiol,2013,61(10):1054-65.

[4] Kwok Y,Kim C,Grady D,et al. Meta-analysis of exercise testing to detect coronary artery disease in women[J]. Am J Cardiol,1999,83(5): 660-6.

[5] Boden WE,O’Rourke RA,Teo KK,et al. COURAGE Trial Research Group. Optimal medical therapy with or without PCI for stable coronary disease[J].N Engl J Med,2007,356:1503-16.

[6] Aziz H,Zaas A,Ginsburg GS,et al. Peripheral blood gene expression profiling for cardiovascular disease assessment[J]. Genomic Medicine, 2007,1(3):105-12.

[7] Sinnaeve PR,Donahue MP,Grass P,et al. Gene expression patterns in peripheral blood correlate with the extent of coronary artery disease[J]. PLoS One,2009,4(9):e7037.

[8] Wingrove JA, Daniels SE, Sehnert AJ,et al. Correlation of Peripheral-Blood Gene Expression With the extent of coronary artery stenosis[J]. Circulation:Cardiovascular Genetics,2008,1(1):31-8.

[9] Libby P, Ridker PM, Maseri A: Inflammation and atherosclerosis[J]. Circulation.,2002,105(9):1135-43.

[10] Martinon F,Tschopp J. Inflammatory caspases and inflammasomes: master switches of inflammation[J]. Cell Death Differ,2007,14(1): 10-22.

[11] Braun NA,Covarrubias R,Major AS. Natural killer T cells and atherosclerosis: form and function meet pathogenesis[J]. J Innate Immun,2010,2(4):316-24.

[12] Michael R Elashoff,James A Wingrove,Philip Beineke,et al. Development of a blood-based gene expression algorithm for assessment of obstructive coronary artery disease in non-diabetic patients[J]. BMC Medical Genomics, 2011,4:26.

[13] Rosenberg S,Lieu HD,Elashoff MR,et al. Whole Blood Gene Expression Testing for Coronary Artery Disease in Nondiabetic Patients : Major Adverse Cardiovascular Events and Interventions in the PREDICT Trial[J].Journal of Cardiovascular Translation. Research,2012,5:366-74.

[14] Rosenberg S,Elashoff MR,Beineke P,et al. Multicenter validation of the diagnostic accuracy of a blood -based gene expression test for assessing obstructive coronary artery disease in nondiabetic patients[J]. Ann Intern Med,2010,153(7):425-34.

[15] Lansky A,Elashoff MR,Ng V,et al. A gender-specific blood-based gene expression score for assessing obstructive coronary artery disease in nondiabetic patients:results of the Personalized Risk Evaluation and Diagnosis in the Coronary Tree trial[J]. Am Heart J, 2012,164:320-6.

[16] Michael R. Elashoff,Rachel Nuttall,Philip Beineke,et al. Identification of Factors Contributing to Variability in a Blood-Based Gene Expression Test[J].PLoS ONE,2012,7(7):e40068.

[17] Gregory S. Thomas,Szilard Voros,John A. McPherson,et al. A Blood-Based Gene Expression Test for Obstructive Coronary Artery Disease Tested in Symptomatic Nondiabetic Patients Referred for Myocardial Perfusion Imaging: The COMPASS Study[J]. Circ Cardiovasc Genet,2013,6:154-62.

[18] Rosenberg S,Elashoff MR,Beineke P,et al. Multicenter validation of the diagnostic accuracy of a blood -based gene expression test for assessing obstructive coronary artery disease in nondiabetic patients[J]. Ann Intern Med,2010,153(7):425-34.

[19] Szilard Voros,Michael R. Elashoff,James A. Wingrove,et al. A peripheral blood gene expression score is associated with atherosclerotic Plaque Burden and Stenosis by cardiovascular CT-angiography:Results from the PREDICT and COMPASS studies[J]. Atherosclerosis ,2014,233:284-90.

[20] Parag H.Joshi,Sarah Rinehart,Gustavo Vazquez,et al. A peripheral blood gene expression score is associated with plaque volume and phenotype by intravascular ultrasound with radiofrequency backscatter analysis:results from the ATLANTA study[J]. Cardiovascular Diagnosis and Therapy,2013,3(1):5-14.

[21] Susan E. Daniels,Philip Beineke,Brian Rhees,et al. Biological and Analytical Stability of a Peripheral Blood Gene Expression Score for Obstructive Coronary Artery Disease in the PREDICT and COMPASS studies[J]. J of Cardiovasc. Trans. Res,2014,7:615-22.

[22] Lee Herman,James Froelich,Dino Kanelos,et al. Utility of a Genomic-based, Personalized Medicine Test in Patients Presenting With Symptoms Suggesting Coronary Artery Disease[J]. J Am Board FamMed,2014,27:258-67.

[23] Steven Rosenberg,Michael R.Elashoff,et al. Whole Blood Gene Expression Testing for Coronary Artery Disease in Nondiabetic Patients : Major Adverse Cardiovascular Events and Interventions in the PREDICT Trial[J].J of Cardiovasc. Trans. Res,2012,5:366-74.

[24] McPherson JA,Davis K,Yau M,et al. The Clinical Utility of Gene Expression Testing on the Diagnostic Evaluation of Patients Presenting to the Cardiologist with symptoms of suspected obstructive coronary artery disease: Results from the IMPACT(Investigation of a Molecular Personalized Coronary Gene Expression Test on Cardiology Practice Pattern ) Trial[J]. Crit Pathw Cardiol,2013,12(2):37-42.

[25] Ashley EA,Hershberger RE,Caleshu C,et al. Genetics and Cardiovascular disease : a Policy Statement from the American Heart Association[J].Circulation.,2012,126(1):142-57.

本文编辑：张灵

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