癌基因诱发的DNA损伤反应与肿瘤生成

刘 力 （中国医学科学院基础医学研究所病原室，北京100005）

·肿瘤病因与转化医学·

癌基因诱发的DNA损伤反应与肿瘤生成

刘 力 （中国医学科学院基础医学研究所病原室，北京100005）

肿瘤的发生与癌基因的激活或抑癌基因的失活有着密不可分的关系．癌基因的活化及抑癌基因的抑制可引发细胞内染色体基因组的复制应激反应．持续的复制应激反应可导致双链DNA断裂或单链DNA复制中间体的产生，从而分别激活两个重要的DNA损伤反应（DDR）通路，即ATM和ATR通路．与此同时，DDR检查点在感知DNA损伤信号后，可诱发细胞周期阻滞．只有损伤的DNA在得以正确修复以后，细胞周期才能再次启动．在细胞发生肿瘤转化的情况下，癌基因在引发DNA损伤的同时，常通过多种途径抑制DDR反应，导致染色体异常的重组与分离，进而促进肿瘤的生成；而癌基因造成的持续的损伤反应，未通过DDR检验点，还可引发细胞的另外一种结局，即最终细胞的老化死亡．

肿瘤生成；癌基因；双链DNA断裂；DNA损伤反应

0 引言

在肿瘤治疗过程中，人们常采用化疗及放疗的方法诱发肿瘤细胞染色体基因组发生断裂，使肿瘤细胞无法修复这种损伤而死亡，从而达到肿瘤治疗的目的［1-2］．另一方面，环境中的致癌成分及长期的电离辐射所造成的DNA损伤也会导致人群中癌症患者的比例增加［3］．研究［4-6］显示，癌基因的过量表达或抑癌基因的失活也会诱发DNA损伤反应，并且这一过程与肿瘤的发生密切相关．DNA损伤除可由外界因素引发以外，还可以由内源性因素引发［7］．其中癌基因的过量表达是引发细胞应激反应进而造成DNA损伤的最主要原因之一．

1 癌基因DNA损伤反应的概念

在DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）过程中，DNA损伤反应检查点（checkpoint）在感知DNA损伤并进一步启动DDR修复机制，维持基因组稳定性上发挥重要作用［8］．DDR在某些情况下可被看作是机体先天免疫反应的组成部分，是对机体受到损伤威胁的一种应激保护机制．与此相反，癌基因的激活以及导致细胞转化的过程是一种对抗细胞DDR的过程［9］．DDR检查点对细胞具有两面性．一方面，当损伤信号适当时DDR检查点可发挥正常功能，并激活DNA损伤修复通路；当损伤信号足够大时DDR检查点因松懈而不能发挥正常功能，使损伤未被修复即进入细胞周期，导致肿瘤的生成；当损伤信号特别大时，细胞周期持续阻滞，DDR检查点被完全阻断，细胞发生凋亡或老化死亡．

2 肿瘤发生过程中抑癌基因引发的复制应激反应

在基因组上分布着许多染色体缺口、异位及经常发生DNA双链断裂（double stand break，DSB）的部位，常发生于有丝分裂中期，被统称为染色体常见的脆性位点（common fragile site，CFS）［10-11］．过去人们普遍认为，基因组上的CFS是一类没有活性的结构区域，但越来越多的研究结果证明，CFS区域常可检测到有功能基因的表达．在小鼠基因组上敲除这些CFS基因后，这些CFS基因敲除小鼠肿瘤的负荷能力大大增加．从而提示，CFS基因的表达产物具有抑癌基因的功能，比如抑癌基因p53除有促进细胞凋亡的作用外，在S期还具有防止DNA复制叉停顿及塌陷的作用［12］．染色体脆性位点FRA3B中含有抑癌基因FHIT，在许多复制应激反应所引发的肿瘤及前癌损伤中，该基因常呈现杂合或纯合缺失［13］．BLESS是一种在核苷酸水平绘制全染色体DSB的新型二代测序方法，主要采用生物素富集断裂标记的方法．BLESS检测显示许多经典的抑癌基因如RB和PTEN虽在肿瘤细胞中缺失，但并未位于CFS区域［14］，说明这些经典的抑癌基因缺失受其他机制调控．

3 肿瘤发生过程中癌基因引发的复制应激反应

癌基因的激活可引发染色体的复制应激反应，这些复制应激反应多发生在染色体CFS区域［15］．发生断裂的区域常是由于复制叉及转录机器的冲撞所致，部分原因是由于CFS区域的复制常发生于S期的晚期，且常与＞1 Mb的基因相连．这些断裂易引起染色体改变，如易位、缺失、放大和超突变等，从而引起基因拷贝数变异（copy number variation，CNV）．

4 复制应激反应与DNA损伤反应通路

传统上可将DNA损伤反应分为三个阶段：感知损伤、信号转导及下游效应．目前已知的DDR通路主要有两条：一条是ATM（ataxia telangiectasia mutated）反应通路，是由与PI3K相关的蛋白激酶，即共济失调-毛细血管扩张突变基因调控的通路［16］；另一条是ATR（ATM-Rad3-Related）反应通路，是由与ATM和酵母Rad3相关蛋白激酶，即 ATR基因调控的通路［17］．当癌基因被激活或抑癌基因被抑制的时候，可引发细胞处于复制应激状态，受染细胞识别这些病毒DNA为自身受损DNA，从而引发DDR．病毒感染诱发的复制应激状态可导致多种自身染色体的损伤，其中最严重的损伤是DNA双链断裂．

双链DNA断裂可激活ATM反应通路．当DSB出现时，其感知复合物MRN（Mre11-Rad50-Nbs1）随即结合到DNA的损伤区域，且ATM蛋白也被募集到该区域，并与MRN复合物相互作用．正常状态下，ATM在蛋白去磷酸酶如PP2A或WIP1作用下形成同源二聚体的非活化状态．DSB可使ATM 1981位点的丝氨酸（S1981）自主磷酸化，并使PP2A从ATM上解离，从而导致ATM由非活化的双体变为活化的单体，ATM单体又进一步被磷酸化及乙酰化，形成功能性ATM单体．随后，活化的ATM在S139位点磷酸化H2AX蛋白，形成活化的γH2AX蛋白．γH2AX蛋白的形成有利于 ATM募集另一个重要的衔接蛋白MDC-1，并使其磷酸化．磷酸化的MDC-1可促使泛素连接酶RNF8和RNF168与其结合，并导致γH2AX泛素化．形成泛素化的γH2AX不仅可在核内DNA损伤部位搭建与修复蛋白53BP1和Brca1的联系，而且也能使ATM进一步磷酸化下游靶基因如Chk2、p53和Cdc25，从而调控细胞周期阻滞及细胞凋亡．

ATR反应通路主要应对DNA复制过程中出现的单链DNA暴露的问题．主要表现为在应激条件下，复制叉停顿（stalling）或塌陷（collapse）可导致单链DNA的暴露．此外，某些DSB也可造成DNA双链的不对称切割，也可形成暴露的单链DNA．复制蛋白A（replication proteinA，RPA）随即覆盖于单链DNA，并通过ATR相互作用蛋白ATRIP募集ATR．拓扑异构酶结合蛋白 1（topoisomerase binding protein 1，TopBP1）也可通过9-1-1复合物（Rad9-Rad1-Hus1）被募集到ssDNA并与ATR及ATRIP蛋白结合．这样ATR的激酶活性就可以被激活，其作用是通过磷酸化活化下游许多效应因子，其中包括很重要的调节因子Claspin．Claspin负责募集Chk1到ssDNA，进而使ATR磷酸化Chk1并激活其激酶结构域，促进相关周期检查点的活化．Chk1是S期内及G2／M检验点的主要效应因子，而Chk2主要在G1／S及S期内发挥作用．

Chk1和Chk2均可磷酸化Cdc25磷酸酶家族，且可通过去除周期素依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）蛋白的抑制性磷酸化作用，而使CDK功能性活化．Chk2可通过磷酸化E2F调控细胞周期进程，Chk1和Chk2还可通过磷酸化p53而影响G1／S周期进程及细胞凋亡．Chk1和Chk2还可通过磷酸化和激活同源重组通路的成分而在DNA修复中发挥作用．

5 肿瘤生成是一种拮抗DDR的过程

肿瘤生成的过程就是对DDR的抑制过程，同时导致细胞周期检查点不对损伤的DNA进行检测［18］．癌基因诱导的复制应激反应所导致的DNA损伤通常可以被 DDR检测到，而 DDR下游的效应因子如Chk1和Chk2的功能常被抑制．EB病毒（epstein-barr virus，EBV）相关的癌基因可使B细胞发生转化，可导致B淋巴瘤等的发生．EBV介导的淋巴瘤生成与EB病毒感染所引起的复制应激反应及DNA损伤有关［19］．该损伤信号可以被ATR通路的感知蛋白所检测，从而激活ATR．研究显示，EBV感染可激活B细胞的STAT3信号通路，而STAT3可以抑制ATR下游信号通路，进而使S期内的检查点松弛．STAT3的活化可以促进caspase 7介导的Claspin蛋白的降解，从而抑制损伤信号由ATR到Chk1的传递．该研究显示，在肿瘤发生过程中 STAT3的持续激活可抑制DDR，从而使S期内的检查点不发挥作用，细胞携带损伤信号进入S期．此外，最近美国杜克大学研究［20］显示，肿瘤细胞存在一种新的可随机诱发DSB的作用机制．研究显示，该机制不依赖于细胞内活性氧应激反应或复制应激反应，而依赖于肿瘤细胞中线粒体所释放的细胞色素C使caspase 3及核酸酶得以激活，进而在细胞核内引发染色体DSB，进而激活ATM通路．ATM的活化可进一步激活肿瘤驱动因子如NFκB和STAT3的表达，从而促进肿瘤的生成．本研究略显不足的是尚不知肿瘤的发生是如何克服DDR机制的？但本研究与EBV诱发B细胞淋巴瘤的研究结果是有相关性的：EBV可激活ATR信号通路，而随机的 DSB可激活 ATM信号通路，二者均可激活STAT3信号通路．因此随机DSB激活的STAT3也可抑制ATM下游Chk2效应因子的功能，从而使细胞周期检查点松弛，DNA损伤不被修复，从而诱发肿瘤的生成．

6 讨论与展望

基因组不稳定性在肿瘤发生中起重要作用，是肿瘤发生的八大标志性事件之一［21］．癌基因激活或抑癌基因的抑制均可引发基因组DNA的复制应激反应，持续的复制应激反应可导致DNA损伤，如复制叉停顿、塌陷或双链DNA断裂．DNA损伤信号可使细胞周期停滞，并激活DNA损伤反应通路，进而对损伤的DNA进行修复．DDR是机体的一种保护机制，对肿瘤的生成具有抑制作用．而癌基因对细胞的成功转化就是克服靶细胞DDR的过程．DNA复制应激反应被认为是肿瘤发生的早期事件，发生于基因组不稳定性之前．癌基因除可促进肿瘤生成以外，还可以促进靶细胞的老化，从而限制细胞的增殖与转化．同一癌基因在不同的组织细胞中可能会产生相反的作用，即癌基因在一种细胞中表现为促进肿瘤生成，而在另外的一种细胞中可能就表现为促进细胞的老化．

深入研究DDR在肿瘤发生过程中的普遍性作用规律将会为未来肿瘤治疗带来新的治疗靶点与策略［22］．不同于已有的放疗及遗传毒性化学治疗，这些方法主要是诱发癌细胞的DNA损伤从而达到杀伤肿瘤细胞的目的，新的治疗策略将基于对作用机制的深入研究与认识．比如可以靶向STAT3进行抑制剂药物筛选，从而抑制癌基因诱发的对DDR抑制作用，激活自身的DDR机制，达到抗肿瘤的目的．而传统的ATM／Chk2及ATR／Chk1抑制剂需要结合其他治疗方法如放疗等［23］，治疗程序复杂，毒副作用也比较大．因此，肿瘤的新治疗策略值得进一步探索与尝试．

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DNA damageresponseandtumorigenesis induced by oncogene

LIU Li
Department of Microbiology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100005，China

Tumorigenesis is closely related to the activation of oncogene or inactivation of tumor suppressor gene．The activation of oncogene or suppression of tumor suppressor gene can induce the replication stress of human chromosome genome．The sustained reaction of replication stress often results in the accumulation of double strand break or single strand DNA replication intermediate，which will in turn activate two important DNA damage response（DDR）pathways，ATM and ATR pathway，respectively．Meanwhile，the detection of the damaged signal by DDR check point can induce cell cycle arrest．Only upon the correct repair on these damage DNAs，the cell cycle can re-initiate．In the presence of cellular transformation，oncogene not only induces DNA damage，but also promotes tumorigenesis by inhibiting DDR through multiple pathways that may eventually lead to the aberrant recombination and／or segregation of the replicative chromosomes．In addition，the sustained DDR induced by oncogene fails to pass the DDR checkpoint which will lead to another cellular outcome，the final cell death through senescence．

tumorigenesis；oncogene；double strand break；DNA damage response

R730．231

A

2095-6894（2017）05-01-03

2017-04-06；接受日期：2017-04-20

国家自然科学基金项目（81272230，81550030）

刘 力．博士，研究员．研究方向：病毒RNA调控及肿瘤信号通路．E-mail：lliu8＠263．net；lliu＠pumc．edu．cn