大、小鼠绿脓杆菌脉冲场凝胶电泳分型研究

冯 洁, 谢建云, 魏晓锋, 胡建华, 高 诚

(1. 扬州大学兽医学院, 扬州 225009;

2. 上海实验动物研究中心, 上海市实验动物质量监督检验站, 上海 201203)

大、小鼠绿脓杆菌脉冲场凝胶电泳分型研究

冯 洁1,2, 谢建云2, 魏晓锋2, 胡建华2, 高 诚2

(1. 扬州大学兽医学院, 扬州 225009;

2. 上海实验动物研究中心, 上海市实验动物质量监督检验站, 上海 201203)

目的 对近年来上海及江苏地区部分单位大、小鼠绿脓杆菌进行分离鉴定，采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型技术作基因型分析，以了解绿脓杆菌流行菌株与宿主之间的相关性。方法 无菌采集上海及江苏地区部分单位实验大、小鼠回盲部内容物进行绿脓杆菌分离培养，采用形态学观察、生化试验对分离菌进行鉴定。提取绿脓杆菌分离株基因组DNA，经Xba I酶切后进行脉冲场凝胶电泳。结果 共分离到67株绿脓杆菌，PFGE图谱可分为39种不同带型，14个基因簇(A-N)，优势簇分别为I、H、B和G，分别占17.9%(12/67)、14.9%(10/67)、13.4%(9/67)和11.9%(8/67)。同一来源地的分离株大多呈现不同的基因簇。 结论 67株细菌具有很大的基因多态性，呈散在分布，未见明显的流行特征。

绿脓杆菌; 脉冲场凝胶电泳(PFGE); 分子分型

绿脓杆菌是一种革兰阴性杆菌，能引起人和动物患病的条件性致病菌，首次发现于患者伤口脓液中。广泛分布于世界各地，尤其偏爱潮湿环境,在空气、土壤、水、正常人和动物的皮肤、呼吸道、肠道等均可检出, 当宿主免疫系统受损，常可引起感染、炎症、败血症甚至死亡等[1-5]。我国实验动物微生物等级及监测标准GB/T 14922.2-2011规定无特定病原体(SPF)实验大鼠和小鼠必须排除该菌[6]。近年我国实验动物绿脓杆菌感染时有发生[7-9]，对实验动物及人类健康造成威胁。本研究对上海及江苏地区部分单位实验大鼠和小鼠绿脓杆菌进行分离、鉴定，采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离株进行分子分型, 以了解大鼠和小鼠绿脓杆菌的流行情况。

1 材料与方法

1.1 材料

脉冲场电泳仪Bio-Rad CHEF Mapper XA、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、比浊仪(法国生物梅里埃公司)、水平低速染、脱色摇床(美国Scilogex公司)、超纯水处理装置(美国Millipore公司); 营养肉汤购自美国BD公司, 细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司, Tris、EDTA、十二烷基肌氨酸钠购自美国Sigma公司, 蛋白酶K、限制性内切XbaI购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株处理 将冻存的绿脓杆菌及标准菌株绿脓杆菌ATCC27853、布伦邓禄普沙门菌H9812 ATCC BAA-664接种至营养肉汤，37 ℃复苏培养。

1.2.2 PFGE分子分型 按照美国疾病控制预防中

心推荐的肠杆菌科细菌PFGE方法进行[10]。

1.2.3 结果判定 根据Tenover等[11]提出的细菌PFGE分子分型的判断标准, 相似度≥75%的指纹图谱为一类PFGE指纹型别, 划分为同一基因簇(clusters);相似度≥99%的指纹图谱为相同PFGE分型。图谱中相似系数在0.85以上的菌株可判为流行病学相关[12]。分辨力用辛普森差异指数(Simpson’s index of diversity, D)表示，计算公式为D=1-{∑ [nj(nj-1)]}/ [N (N-1)], 其中nj为属于第j个型别的菌株数, N为特定群体中的总菌株数。D值介于0～1, 越趋于1表示该方法分辨力越好。

2 结果

2.1 菌株分离

共分离67株绿脓杆菌，溴化十六烷基三甲铵萘啶酸培养基(NAC)平皿上生成2～ 3 mm、湿润有光泽的菌落，其中56株产生色素，11株不产生色素。油镜下观察可见革兰小阴性杆菌，两端钝圆，排列不规则，未见荚膜和芽孢。生化鉴定结果显示均为绿脓杆菌。

人文主义精神是一种普遍的人类自我关怀，表现为对人的尊严、价值、命运的维护、追求和关切[4]。受市场经济等因素影响，我国医疗卫生事业中部分医务人员道德素质下降，医患关系日益紧张，对医学生自身发展和病人健康造成冲击，医学的人性光芒日趋黯淡，医学的人文主义精神衰落，同样也对整个社会的伦理道德产生严重冲击。为此，加强医学生人文主义教育成为高等医学院校思想政治教育的主要任务，具体内容及实施路径见图1。

2.2 PFGE分型

细菌经酶切后电泳, 利用BioNumerics软件进行聚类分析显示(图1), 67株绿脓杆菌均能被Xba I内切酶切开。根据相似度100%的为同一PFGE型别的原则，67株细菌共分为14个基因簇(A-N), 39种不同带型。每种带型包含菌株数为1～5株不等，其中24种带型(61.54%)分别只包含1株菌, 其它15种带型包含菌株数大于1株。分型的D值为0.9778。

2.3 菌株的分布

67 株细菌共分为14个基因簇，其中优势簇分别为I、H、B和G, 分别占17.9%(12/67)、14.9% (10/67)、13.4%(9/67)和11.9%(8/67)。

结合菌株分型信息、动物来源地和品系作进一步分析，表明同一来源地的分离株大多呈现不同的基因簇，表明绿脓杆菌的感染源不同，例如来自P20的8只C57BL/6小鼠分别为G1、G2、G3、G4、G5、F3、I7型。但有少数同一地点的同一品系动物，也可呈现相同基因簇，例如P6的4只ICR均为A1型; P18，5只BALB/c小鼠均为F1型；此外，如P9共分离5株细菌，其中ICR为H5型，C56BL/6为C1型，而3只裸小鼠则均为D1型。上述现象提示，同一来源地的动物品系与菌株之间存在一定的关联性。

综上PFGE分型信息表明， 67株细菌具有很大的基因多态性，呈散在分布，未见明显的流行特征，结果存在来源地和品系上的聚类。

3 讨论

细菌分型主要有表型分型、基因分型等方法。传统的细菌分型方法是基于细菌的表型特征，如菌体形态特征、血清型、噬菌体型等进行分类，在细菌鉴定过程中起重要作用，但也存在缺陷，如不能提供菌株间足够的相关联系信息，标准血清的制备、分型率和分辨率不理想，不能满足应对紧急情况时的要求等。

随着分子生物学技术的不断发展，以基因型为基础的细菌分型方法在微生物分子流行病学调查研究中应用日益广泛。与血清分型方法相比，分子分型方法是从核酸水平对菌株间的差异进行区分，可将几乎所有菌株进行分型，能避免交叉反应。其中PFGE因可重复性高、分辨力强，已成为细菌分子流行病学调查的“金标准”[13,14]。本文利用PFGE技术对大、小鼠绿脓杆菌分离株进行分子分型，整体结果显示，67株细菌具有很大的基因多态性，呈散在分布，未见明显的流行特征，大多数设施内可分离到不同的基因型。但同一来源地相同品系动物可出现相同的基因型，说明来源地和动物品系存在聚类，这与文献报道一致[15]。作者分析其原因可能与实验动物特殊的饲养和管理方式有关，故应加强对该菌的重视，应定期监测，以减少对动物群体和工作人员的相互传染，在动物的引进和日常饲养管理中应加以重视和规避。

绿脓杆菌作为一种条件致病菌，影响人类与动物的健康和动物试验结果。本研究对上海、江苏地区部分单位大、小鼠绿脓杆菌分离株进行PFGE分子分型，进一步丰富了我国实验动物绿脓杆菌分子流行病学资料，可为今后实验动物绿脓杆菌的防控和质量管理提供一定的参考依据。

[1] 徐建国, 梁国栋, 邢来君, 等. 临床微生物学手册[M]. 北京:科学出版社, 2005:739-745.

[2] 金宁一, 胡仲明, 冯书章. 人兽共患病学[M]. 北京: 科学出版社, 2007:643-656.

[3] 王惠川, 白广星, 刘文军, 等. 实验小鼠疾病[M]. 北京: 北京农业大学出版社, 1988.

图1 67株绿脓杆菌分离株PFGE聚类分析结果Figure 1 PFGE profile of Pseudomonas aeruginosa

[4] 韩青松, 简永利, 涂宜强, 等. 绿脓杆菌研究进展[J]. 畜牧与饲料学, 2012(1):122-124.

[5] Hammond CW, Tompkina M, Miller CP, et al. Studies on the susceptibility to infection following ionizing radiation. I the time of onset and duration of the endogenous bacteremias in mice[J]. J Exp Med, 1954, 99(5):405-410.

[6] GB/T 14922.2-2001. 实验动物微生物学等级及监测[S].

[7] 邢进, 高正琴, 冯育芳, 等. 北京地区2008-2011年实验动物绿脓杆菌检测结果与分析[J]. 实验动物科学, 2012, 29 (3):24-26.

[8] 葛文平, 张旭, 高翔, 等. 我国商业化SPF级小鼠病原体污染分析[J]. 中国比较医学杂志, 2012, 22(3):65-68.

[9] 冯洁, 谢建云, 冯丽萍, 等. 培养法和PCR法用于实验大、小鼠细菌检测的比较分析[J]. 中国比较医学杂志, 2015, (8):23-26.

[10] Ribot EM, Fair MA, Gautom R, et al. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for Pulse Net[J]. Foodborne Pathog Dis, 2006, 3(1):59-67.

[11] Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsedfield gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing [J]. J Clin Microbiol, 1995, 33:2233-2239.

[12] 石小路, 扈庆华, 王冰, 等. 深圳市伤寒PluseNet数据库的初步建立与应用[J]. 现代预防医学, 2007, 34(17):3201-3203.

[13] Lau YJ, Liu PY, Hu BS, et al. DNA fingerprinting of Pseudomonas aeruginosa serotype O11 by enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction and pulsed-field gel electrophoresis[J]. J Hosp Infect, 1995, 31(1):61-66.

[14] Grundmann H, Schneider C, Hartung D, et al. Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(3):528-534.

[15] 邢进. 北京地区实验动物中绿脓杆菌耐药分析及PFGE 和MLVA分型方法比较[D]. 北京: 中国人民解放军军事医学科学院, 2012.

Molecular Subtyping Study on Pseudomonas aeruginosa in Rats and Mice with Pulsed Field Gel Electrophoresis

FENG Jie1,2, XIE Jian-yun2, WEI Xiao-feng2, HU Jian-hua2, GAO Cheng2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals, Shanghai 201203, China)

Objective To investigate the correlation between Pseudomonas aeruginosa epidemic strains and host in recent years, Pseudomonas aeruginosa in rat and mice from several faciliies of Shanghai and Jiangsu province were isolated and detected by pulsed field gel electrophoresis (PFGE).MethodsThe bacteria were isolated from the contents of ileocecal junction under aseptic conditions. The isolated strains were identified by morphological observation and physicochemical test. Extracted genomic DNA of Pseudomonas aeruginosa isolates were detected by PFGE after digested by Xba I restriction enzyme.ResultsA total of 67 strains were isolated from rats and mice. The genotype of 67 strains was divided into 39 patterns and 14 clusters (A-N). The dominant cluster is I, H, B and G, the rate of these cluster were 17.9%(12/67), 14.9%(10/67), 13.4%(9/67) and 11.9%(8/67) respectively. The isolates from the same source mostly present different gene cluster.ConclusionA great deal of gene polymorphism could be found in all the 67 strains which are diffusively distributed. Obvious prevalent feature could not be found.

Pseudomonas aeruginosa; Pulsed field gel electrophoresis (PFGE); Molecular subtyping

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0419-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.003

2016-07-22

上海市科技创新行动计划(14140900600、12140900500), 上海市科委研发平台专项(15DZ2292400)

冯 洁(1981-), 女, 副研究员。E-mail: moyifj@163.com

高 诚(1961-), 男, 研究员。E-mail: gaocheng@slarc.org.cn