ALK-TKIs耐药的研究进展

陈燕琼 周韶璋

作者单位：530021 南宁 1广西医科大学附属肿瘤医院化疗科；2广西医科大学研究生院

ALK-TKIs耐药的研究进展

陈燕琼1，2周韶璋1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院化疗科；2广西医科大学研究生院

间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂（anaplastic lymphoma tyrosine kinase inhibitors，ALK-TKIs）的问世改变了棘皮动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）融合基因突变的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的治疗策略，使此类患者得到了明显的生存获益。然而，几乎所有酪氨酸激酶抑制剂治疗后一年内不可避免地出现耐药，制约临床效益发挥，本文就ALK-TKIs的常见耐药机制及耐药后的应对策略作一综述。

肺肿瘤；ALK-TKIs；EML4-ALK；耐药机制；非小细胞肺癌

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的类型，占肺癌的 80%～85%，突变基因 EGFR、ALK、ROS1、KRAS的发现及靶向制剂的应用使这类患者从有效性差、毒副反应大的化疗中解脱。ALK基因阳性的NSCLC患者应用间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂（anaplastic lymphoma tyrosine inhibitors，ALK-TKIs）治疗较常规化疗可显著获益，临床研究证实，克唑替尼治疗的有效率＞70%，无进展生存期（progression-freesurvival，PFS）近11个月［1］。但和其他靶向药一样，ALK-TKIs也不可避免地出现耐药，成为治疗的瓶颈，限制药物发挥更大的疗效。本文就ALK-TKIs的耐药机制及耐药后的应对策略作一综述。

1 EML4-ALK融合基因

棘皮动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）融合基因2007年由日本学者Soda等［2］发现，并证实为肺癌驱动基因，EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和p23上，细胞内ALK基因与带有N端的EML4倒位融合，通过刺激PI3K/AKT/MAPK信号通路诱发酪氨酸激酶活性，导致肿瘤细胞增殖分化并抑制凋亡。EML4-ALK融合基因占NSCLC的3%～7%，多发生于非吸烟、年轻的女性腺癌患者。针对EML4-ALK融合基因，临床上涌现出许多高效的ALK-TKIs，包括一代克唑替尼、二代艾乐替尼、色瑞替尼、Brigatinib和三代Loratinib等。

2 克唑替尼

克唑替尼（PF-02341066，xalkori）是第一个被 FDA批准的ALK-TKIs，用于ALK阳性的NSCLC的一线治疗，克唑替尼是MET、ALK、ROS1基因改变都有活性的多靶点酪氨酸激酶抑制剂［3-4］。PROFILE1014随机Ⅲ期临床研究表明，克唑替尼能显著提高ALK阳性NSCLC患者一线治疗的无进展生存期和客观缓解率，且安全性良好［1］，客观缓解率达60%，无进展生存期达8～10个月，总生存期显著延长［5-7］，但往往在初始治疗后一年内出现克唑替尼耐药，其中，中枢神经系统转移最为常见［8］。

2.1 ALK激酶区域的二次突变

ALK激酶区域的二次突变是最早明确的耐药机制［9-10］，占克唑替尼耐药的28%。2008年Choi等［11］首次在对克唑替尼耐药患者的胸腔积液中检测到序列4374G→A和4493C→A两种突变基因，相应序列C1156和L1196表达的氨基酸发生了改变。2010年Sasaki等［12］证实L1196突变可能创建了一个空间位阻阻止克唑替尼结合，F1174L突变可能促进ALK活化构象的产生，从而不利于克唑替尼的结合，使其优先结合无效构象ALK。2011年在ALK和活化的EGFR信号中的一个二次突变（L1152R），导致1152位置上的亮氨酸被精氨酸取代［13］。Zhang等［14］在激酶活性部位周围检测到5个区域的残基突变，除已知的C1156、F1174、L1196和L1152等突变外，还检测到另外两种新的二次突变S1206和I1171。Doebele等［15］证实位于ALK的ATP结合区末端的二次突变G1269A，体外实验也印证了G1269A能够促进ALK永久性磷酸化，激活下游效应器，使克唑替尼耐药。Katayama等［10］在18例克唑替尼耐药患者中发现4种耐药突变：3种错义突变（L1196M、G1202R和S1206Y）和 1种氨基酸（苏氨酸）插入突变（1151Tins）。这些激酶域的突变通过增加空间位阻、活化ALK的构象、使ALK永久磷酸化等途径影响药物与活性位点的结合，最终导致克唑替尼耐药。

2.2 ALK融合基因拷贝数的扩增

ALK融合基因拷贝数的扩增是克唑替尼耐药的可能机制之一。Katayama等［10］在对克唑替尼耐药的18例肺腺癌患者及在H3122（含EML4-ALK突变体1）获得性耐药细胞系中检测到ALK融合基因大量扩增。当ALK融合基因激酶区域发生二次突变或拷贝数增加时，ALK信号通路往往被保留，并在肿瘤的生存和耐药过程中发挥作用。因此，使用更加有效的第二代、第三代ALK抑制剂也许能够克服这些机制引起的继发性耐药问题。

2.3 信号旁路的激活

ALK属于酪氨酸激酶，其下游的信号通路主要包括PI3K/AKT/mTOR、Ras/MEK/ERK 和JAK3-STAT3，这些信号与细胞存活和增殖有关，克唑替尼通过与其靶点的特异性结合抑制EML4-ALK下游信号的表达而诱导细胞凋亡。当信号旁路激活时，信号传导会绕过抑制剂作用的原始靶点，通过信号旁路激活下游信号，使克唑替尼不能充分抑制肿瘤生长，从而导致耐药的产生。这些不依赖于ALK的耐药机制包括激活EGFR、KIT、IGF-1R等信号通路。Sasaki等［13］在DFCI076细胞株（来源于对克唑替尼耐药的患者）中发现EGFR的配体——双调蛋白EGF的自分泌，在DFCI076细胞系中没有发现ALK的二次突变，而是EGFR的激活增加，且证实在H3122细胞中加入EGF因子刺激可导致对克唑替尼耐药，提示EGFR配体的增加可诱导EGFR激活，而克唑替尼联合EGFR-TKI能克服这种耐药，提示在靶向药物治疗耐药后，了解其耐药的分子机制，再针对性地选择另一种靶向药物可能有效。这为克唑替尼耐药但未发生二次突变的患者提供一种可能的治疗策略。Katayama等［10］在2例克唑替尼耐药的患者中发现了cKIT扩增，这种耐药需要同时激活cKIT及其配体干细胞因子（SCF），而使用KIT抑制剂伊马替尼能逆转这种耐药。IGF-1R是一个四聚体酪氨酸受体，与其配体IGF-1、IGF-2结合后，通过激活 下 游 PI3K/AKT/mTOR、MAPK/RAF/ERK和 JAK3-STAT3，刺激细胞生长和增殖，减少细胞凋亡。多项研究表明，IGF-1R信号转导体系在多种临床有效的抗肿瘤药物耐药中发挥重要作用，IGF-1R及其配体过表达能使患者对放化疗产生抵抗，在体内沉默IGF-1R表达及抑制其信号传导能够抑制肿瘤生长并增强肿瘤细胞对化疗的敏感性［16］。Li等［17］通过在肺腺癌细胞株 H2228（EML4-ALK突变体3b E6；A20）中加入IGF-1因子，使H2228细胞株对克唑替尼耐药，且加入二甲双胍后能使耐药细胞对克唑替尼再次敏感，考虑二甲双胍可能通过IGF-1R信号通路发挥了作用。

2.4 其他耐药机制

上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）是指细胞由上皮特性转变为间质细胞特性。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质能力等间质表型。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。近年来，多项研究结果提示EMT与肿瘤干细胞形成、耐药和肿瘤转移关系密切。在NSCLC中，Zhou等［18］报道EMT与酪氨酸激酶抑制剂的耐药相关。Kim等［19］在诱导的克唑替尼耐药细胞H2228CR中，发现EMT的标志蛋白E-Cadherin、Vimentin表达和细胞转移力有关，表明EMT与克唑替尼的耐药相关。

3 艾乐替尼

艾乐替尼是第二代的ALK-TKI，具有高度的选择性，其效力比克唑替尼强10倍。体外研究发现艾乐替尼对ALK激酶的半抑制浓度（IC50）仅为1.9 nmol/L，能够抑制大多数ALK激酶区的继发性耐药，主要有L1196M、C1156Y及G1269A［20］，从而克服克唑替尼耐药，且对中枢神经系统转移瘤有良好的渗透性，总有效率（overall response rate，ORR）达93.5%。日本癌症国立中心医院一项随机、开放Ⅲ期研究J-ALEX显示，艾乐替尼一线治疗ALK阳性患者的中位PFS为20.3个月，显著优于克唑替尼（10.2个月），且耐受性良好，不良反应更轻。但和其他ALK-TKIs一样，艾乐替尼单药治疗的最初1年内，患者出现明显的获得性耐药。

3.1 ALK激酶区域的二次突变

Katayama等［21］通过药物浓度递增的方式构建了艾乐替尼的耐药细胞株，在耐药细胞株中发现两种新的ALK突变：V1180L和I1171T，且另一个二代ALK抑制剂ceritinb及热休克蛋白抑制剂能克服这种耐药。其他与艾乐替尼耐药相关的突变有L1196M、G1202R。

3.2 旁路的激活

Tanimoto 等［22］揭露了 EGFR 配体 EGF、TGF-α、HBEGF的旁分泌通过激活EGFR信号通路引起了克唑替尼耐药。Isozaki等［23］构建了2株艾乐替尼耐药细胞株：H2228/CHR和ABC-11/CHR（含EML4-ALK突变体3b E6；A20），2株耐药细胞株均未检测到ALK的二次突变。但在H2228/150nM细胞中，发现ALK表达逐渐减少，同时对艾乐替尼的敏感性也逐渐降低，最终在H2228/CHR细胞株中，出现了EML4-ALK的丢失并激活了IGF-1R、NRG1/HER3信号通路，下游AKT、ERK磷酸化增加，联合应用OSI-906（IGF-1R抑制剂）和厄洛替尼（EGFR抑制剂）能显著抑制AKT存活通路，从而克服耐药。有趣的是，ABC-11/CHR细胞系中没有出现ALK丢失而出现了MET的活化，并发现MET的配体HGF表达显著增加，加入外来的HGF刺激能使亲本细胞系H2228和ABC-11对艾乐替尼耐药，在加入抗-HGF抗体治疗后，能降低MET的磷酸化水平及下游信号通路，增加艾乐替尼的敏感性。更令人惊喜的是，在加入0.1 μmol/L的克唑替尼后，MET和ALK的磷酸化和下游的AKT、ERK磷酸化都受到了明显抑制，对艾乐替尼耐药的ABC-11/CHR细胞株对克唑替尼表现出敏感性。

4 色瑞替尼

色瑞替尼是ATP竞争性小分子ALK抑制剂，其靶点包括ALK、IGF-1R、InsR，其临床效价比克唑替尼高20倍，对ALK激酶区的二次突变C1156Y、L1196M、G1269A、S1206Y、I1171T引起的克唑替尼耐药具有显著活性，且对中枢神经系统转移有效，对ALK激酶的IC50仅为0.15 nmol/L，2014年4月FDA批准用于治疗克唑替尼治疗不耐受或疾病进展的ALK+NSCLC。Friboulet等［24］在11例色瑞替尼耐药的患者活检标本中检测到5例患者激酶区域出现了二次突变：F1174C/V和G1202R。值得注意的是，G1202R是克唑替尼、艾乐替尼和色瑞替尼共同的耐药突变，由于精氨酸空间效应的影响，使ALK抑制剂与其靶点之间产生了空间位阻，影响了ALK抑制剂与ALK结合，从而导致耐药。体外实验证实C1156Y、1151Tins和L1152R也介导了色瑞替尼的耐药。Ryohei Katayama等［25］在色瑞替尼和克唑替尼耐药的患者中发现 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）过表达，且在细胞系中发现P-gp/ABCB1能介导色瑞替尼和克唑替尼耐药，沉默ABCB1基因或使用P-gp抑制剂能使细胞对药物再次敏感。P-gp是一种能量依赖性药物排出泵，可以与抗肿瘤药物结合，也有ATP结合位点，结合药物后利用释放ATP的能量将药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度不断降低，从而引起耐药。

5 二代Brigatinib

Brigatinib是一个强效的选择性ALK、EGFR双重抑制剂，对ALK激酶的IC50仅为0.62 nmol/L，对已知的ALK-TKIs耐药的ALK二次突变有效，能对抗难治性耐药突变G1202R［26］，已被FDA授予治疗克唑替尼耐药的ALK+NSCLC患者的突破性药物资格和孤儿药物资格，有望在2017年上市。在Ⅰ～Ⅱ期临床研究中与Brigatinib相关的耐药突变未见报道。头对头比较Brigatinib和克唑替尼用于既往未接受ALK-TKIs治疗的局部晚期或转移性ALK+NSCLC患者的安全性和疗效的Ⅲ期临床试验正在进行。

6 Lorlatinib

Lorlatinib是第三代ALK-TKI，是一种可逆、强效ATP竞争性小分子ALK和ROS1抑制剂，相比现有的ALKTKIs，其潜在的优势在于有更高的中枢神经系统活性，且对ALK已知的耐药突变具有较强的抑制作用［27］。Lorlatinib目前还处于Ⅱ期临床试验阶段，其耐药信息仅在新英格兰医学杂志上报道了1例［28］。该研究报道一名52岁的转移性ALK+NSCLC女性患者，一线使用克唑替尼维持了18个月后出现了腹腔淋巴结转移，活检提示ALK激酶区域C1156Y突变，改用二代色瑞替尼，5周后肝脏发生转移，再使用热休克蛋白抑制剂无效，换用培美曲塞+卡铂缓解了6个月，化疗进展后再次接受克唑替尼治疗，结果无效；患者随即加入LorlatinibⅠ期临床试验，8个月后肝脏病灶恶化，再次活检提示C1156Y+L1198F双突变，两者突变频率相似，且发生在同一等位基因上，而克唑替尼可能抑制这种复杂突变，患者再次使用克唑替尼治疗，肿瘤迅速缓解，并持续6个月，疾病再次进展时，活检已无L1198F突变，患者最终因严重的肝衰竭死亡。进一步对ALK突变进行细胞学和生化特征分析，验证了C1156Y能引起克唑替尼和色瑞替尼耐药；而L1198靠近ATP结合位点，亮氨酸被苯丙氨酸替换后产生的空间位阻干扰了腈类Lorlatinib结合。克唑替尼对L1198F的敏感，及L1198F与克唑替尼亲和力的增加，抵消了C1156Y激酶活性的增加，使双突变对克唑替尼恢复敏感。患者在整个治疗过程中，反复进行活检，提示重复活检对复发性患者十分重要，活检样本的分子分析，有助于更好地了解耐药机制，从而进一步选择最优的治疗药物。

7 小结

随着EML4-ALK的发现及ALK-TKIs的快速发展，ALK阳性患者的个体化治疗精准有效，但由于长期治疗最终导致获得性耐药，严重限制了药物的临床应用。ALK-TKIs的耐药机制复杂，在同一个体可能会有几种耐药机制共存，比如在ALK激酶区域出现双突变，或是既存在ALK突变又存在旁路的激活，且不同的靶向药物可能存在共同的耐药机制，区分不同的耐药模式对后续治疗至关重要。随着研究的深入，越来越多的耐药机制被认识，包括ALK激酶区域的二次突变、融合基因扩增、旁路激活、上皮间质转化等，了解药物治疗失败的内在原因能够更合理地应用TKIs，并使其临床受益最大化。在临床工作中，当患者出现疾病进展时，需要进行重复的活检采样，通过组织活检明确获得性耐药的分子机制，进而确定更换TKIs的精确顺序，或者联合其他TKIs、热休克蛋白 90（HSP90）抑制剂、新突变靶标抑制剂、化疗等。未来需找到一种最优的方法，更好地筛选出优势人群，并监测耐药发生，进而指导继发耐药后的靶向治疗策略及使用合理的联合治疗方案。新兴的液体活检能解决组织活检实施困难的问题，但仍需要不断提高液体活检技术降低假阴性的发生，进而更好地为ALKTKIs耐药群体服务。随着ALK-TKIs耐药分子机制的日渐明朗，更多针对耐药机制的抑制剂正在被研发，相信不久的将来，ALK阳性的NSCLC患者能实现真正意义上的个体化治疗，获得更大的生存受益。

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［2017-03-14收稿］［2017-05-11修回］［编辑 江德吉］

R734.2

A

1674-5671（2017）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.18

国家自然科学基金资助项目（81260357）；广西自然科学基金资助项目（2015GXNSFAA139162）

周韶璋。E-mail：zhoushaozhang@qq.com