石墨烯在生物医学中的应用*

魏丽君 曹均凯

由于肿瘤切除、骨骼畸形、骨折及感染等造成的大块骨缺损，使其快速愈合及重建对于骨组织再生来说比较困难，若发展该领域则需要能使细胞附着、增殖和分化[1-2]的基质，将几种不同的材料复合后，可引发、刺激并维持一系列反应，最终使得细胞分化并生成骨。例如，胶原蛋白虽可为细胞的生长和分化提供适宜表面[3]，但其机械性能差且容易产生免疫反应[2]，因此，具有理化性能可调的水凝胶可为干细胞的命运起到积极引导作用，但它们有可能会缺乏细胞特异性的生物活性。针对干细胞研究来说，具有内在特性的材料在维持细胞的生长和诱导其分化方面有着巨大潜力。

石墨烯是二维碳原子平面结构，是已知最轻的、最薄的，也是强度最高的材料[4]。由于石墨烯极易官能化，故可在生物医学的应用中开辟新途径(例如，生物传感器，用于药物和基因递送以及癌细胞成像等)[5-7]。石墨烯可从较纯的石墨中合成且表面可调节，它已成为间充质干细胞(MSCs)、神经干细胞、诱导多能干细胞等贴壁细胞用于实验的基质[5,8]。因石墨烯具有较高的机械强度和导电性，从而为新的DNA测序技术提供支持，并用于葡萄糖、血红蛋白生物传感器和胆固醇水平方面的研究[9,10]。在石墨烯合成和功能化的进展中，进一步探索其在药物和基因传递以及在组织工程中的潜在应用[6]。

1.石墨烯及其特性

石墨烯属于纯芳香族碳系统，其特性是在室温下具有高电子迁移率[11]，且具有优异的热和化学稳定性[12]。它几乎透明，吸光率仅约2.3%，肉眼稍微可见[13]。可通过以下方法获得不同形式的石墨烯。机械剥离法，也被称为“透明胶带”技术，是用胶带将微米尺寸的石墨烯薄片从石墨晶体中剥离[14]；氧化还原法，以石墨为原料采用强酸将其氧化，在单个的石墨烯片之间插入氧原子[15]；化学气相沉积法(CVD法)[16]，这是一种可通用和可扩展的方法，此法用于生产大规模和高质量的石墨烯。不同的方法所产生的石墨烯具有不同数目的层和/或化学基团。

氧化石墨烯(GO)是天然石墨的高度氧化形式，是新颖的二维纳米材料。它具有良好的生物相容性和低毒性，由于在片层边缘含有含氧基团，这种两亲性化合物可表面官能化，并且可在水溶液中分散，官能化的GO可以改变其属性，因此，修饰后的GO可用于许多生物应用中。

2.石墨烯的毒性

判断一种材料对于生物体是否有毒性是生物医学应用最重要的标准。有研究结果显示，山羊来源的骨髓间充质干细胞在涂有GO(0.1mg/mL)的培养皿中能够增殖[17]。Yang等[18]在昆明鼠体内分别静脉注射1mg/kg和10mg/kg的单层石墨烯，观察14天后石墨烯低浓度组鼠体内未出现明显的炎症反应，但在高浓度组中，鼠肺部出现明显的炎症反应、肺部水肿和肉芽病变等。也有研究表明，哺乳类动物的细胞在接触到石墨烯后活性略有下降，这是由于细胞被诱导氧化应激和细胞凋亡而造成的[14]。石墨烯最亲水的形式就是能够穿透细胞膜，而相比疏水的形式来说累积在细胞膜表面的毒性就更小了。

3.石墨烯在生物医学中的应用研究

3.1 抗菌的应用 石墨烯可以防止病原菌和腐蚀性微生物的形成，甚至能杀死细菌，使其可能成为外科设备或其他表面的抗微生物涂层材料[19]。细菌接触到石墨烯材料后使其自身活力下降[20]，是细菌膜与石墨烯片的尖锐边缘直接接触造成的机械损伤，也可能涉及到氧化应激效应[21]。2010年,Hu等[22]首次报道了石墨烯具有优异的抗菌性,研究发现氧化石墨烯纳米悬液与大肠杆菌共培养2h后,对大肠杆菌的抑制率超过90%。

对基于石墨烯复合材料如含石墨烯的壳聚糖聚乙烯醇纳米纤维支架进行了伤口愈合潜力试验的探索[23]。相比其他组，含有石墨烯组能够加速伤口愈合，认为这是石墨烯的自由电子抑制细胞分裂和防止微生物繁殖的结果。随后的抗菌实验是用农杆菌、大肠杆菌和酵母菌以证实石墨烯可抑制原核细胞(农杆菌和大肠杆菌)的生长，而真核细胞(酵母菌)不受抑制。这对于真核细胞包括人成纤维细胞[24]来说，石墨烯具有抗菌活性且无明显的细胞毒性，表明含有石墨烯的复合材料可用于临床应用。2012年，美国科学家研究出一种能探测人体体内病菌的牙齿芯片，这是由石墨烯材料制作的平面电子芯片传感器，将其安装在牙齿表面，可在病人一呼一吸间搜集口腔内的细菌信息，通过内置的无线网络将信息传送至计算机中，医务人员可分析细菌是否有进一步感染和扩散的可能。

3.2 药物和基因传递 近些年石墨烯及成员(包括GO和rGO)因其生物相容性被应用于生物医学[25]。石墨烯良好的药物承载能力促使大量研究者在不同类型的癌症中探索其性能。根据总体趋势，研究最多的肿瘤是乳腺癌，占总数的31%[26]，其次是宫颈癌[27]和肝癌[28]，分别占23%和10%。其它癌症的类型如皮肤癌[29]，神经胶质瘤[30]等通过不同的药物与石墨烯或GO共轭治疗已有研究。

3.2.1 药物递送 诸多研究使用聚乙二醇(PEG)以增加石墨烯或GO的生物相容性和稳定性并通过π-π堆积和疏水性交互作用负载抗癌药物[25]。Liu等[31]用不同的配体如针对大脑肿瘤的转铁蛋白和阿霉素(DOX)使GO-PEG的表面官能化。与转铁蛋白和DOX共轭的纳米材料显示出更高的细胞内传递效率，并对脑胶质瘤具有更强的毒性。

Zhang等[26]提出了一个非常创新的方式，利用官能化的GO用于生物医学研究中。作者首先利用磺酸使GO功能化，后将叶酸共轭连接至GO中，同时负载阿霉素(DOX)和喜树碱(CPT)两种抗癌药物，形成FA/GO/DOX/CPT复合物特异性靶向乳腺癌MCF-7细胞。实验结果表明，负载有DOX和CPT的石墨烯复合物对MCF-7细胞的靶向性更强，抗肿瘤性更高。

3.2.2 基因递送 石墨烯复合物作为智能基因(siRNA、dsRNA和聚核苷酸)的载体也广泛应用于基因相关疾病的治疗[27]。例如，Zhi等成功地使用GO共递送药物(阿霉素)与siRNA抗miRNA-21(抗-miR-21)作用于乳腺癌细胞。研究发现，将GO作为化疗药物和siRNA的载体有利于肿瘤治疗[32]。Yin等进行另一项研究，专注于黑色素瘤[29]，这是一种病因较复杂的严重性疾病，通过免疫治疗和靶向治疗有广阔的前景[33]。在此背景下，作者证明了用GO作为Stat3 siRNA的载体，研究结果表明在小鼠体内治疗后无毒性，且肿瘤的生长和肿瘤的重量显著消退[29]。

3.3 在神经科学领域的应用 目前，对脑功能的研究技术主要依靠神经元信号电子监控和模拟。光学成像和电生理记录是阐明在神经系统疾病中个人的神经回路如何运作的关键，电子技术和光学技术相互区别同时优势互补。迄今为止，不论是高分辨率光学图像还是电生理数据只能分别获得，因为传统的不透明的金属微电极会阻碍观察者的视野并产生暗影。然而，一个透明的柔性的石墨烯电极能够同时光学成像和电生理记录[34]。

透析脑部的解剖结构与功能一直是神经科学领域所追求的目标，程国胜团队的研究结果发现，二维石墨烯薄膜与海马神经元细胞之间有良好的生物相容性，且二维石墨烯能显著促进神经突起的发生和生长。后期的研究表明，三维石墨烯支架不仅对神经干细胞的增殖起到促进作用，还且很大程度上可诱导神经干细胞定向分化为功能神经元。

石墨烯还具有优良的生物相容性且显著地促进小鼠海马细胞的轴突发育和生长[35]。与在聚苯乙烯材料上相比，在石墨烯片上接种细胞后轴突的数量和轴突的平均长度显著增强。

3.4 石墨烯在骨组织工程中的应用 在骨组织工程中，支架材料尤为重要，它不但为特定的细胞提供支撑结构，而且还可引导组织再生。由于颌骨肿瘤切除、感染、牙周炎等造成的骨缺损在临床较为常见，但是骨重建是一项重大的挑战，这是一个全球性的健康问题。基于干细胞的治疗有望成为最佳的解决方案，但是它需要生物相容性优良并能够促进细胞粘附、迁移和分化的材料作为载体。

例如，由于羟基磷灰石(HA)与骨骼内的无机成分相似，故磷酸钙陶瓷通常用于骨修复或骨再生[36]。在HA中加入GO可以提高涂层的粘着强度，并且GO/HA复合物涂层比单纯HA涂层更具有耐腐蚀能力[37]。将石墨纳米片(GNP)加入至45S5生物玻璃中可形成一种具有高导电性的复合物，这种导电生物材料可在骨组织工程中磷酸钙陶瓷应用，能促进成体干细胞生长并且通过电生理信号的传递使组织再生[38]。

壳聚糖水凝胶可作为支架材料用于修复骨及软骨，但是机械强度和弹性较差。若在水凝胶中加入GO，形成GO/壳聚糖/β-甘油磷酸钠复合温敏凝胶具有更好的理化性质和生物学特性[39]。石墨烯的浓度决定这种复合物材料的应力强度和弹性强度。Wang等[40]研究发现氟化的石墨烯不仅可增强MSCs的粘附和增殖能力，还可在很大程度上促进MSCs的生长。

已研究石墨烯和GO对诱导多能干细胞(iPS细胞)的增殖和分化，为再生医学的细胞来源带来了希望[41]。与在玻璃表面相比，培养在GO表面上的iPS细胞以更快的速度粘附和增殖，此外，石墨烯很好地维持了iPS细胞未分化的状态，通过GO使其加速分化。在人间充质干细胞(hMSCs)和预成骨细胞上研究了石墨烯和GO的分化潜能[42]。与其它表面包括玻璃相比，石墨烯和GO能够促进hMSCs的粘附、增殖和分化。

4.总结与展望

石墨烯是纳米生物技术中迅速崛起的新兴材料。尽管它的历史较短，但它优良的理化性能和生物学特性备受研究者关注。到目前为止石墨烯应用于多种生物医学，包括神经科学、药物和基因载体、抗菌材料、组织工程支架等。

改性的石墨烯与支架材料有良好的生物相容性，可诱导细胞粘附和增殖，并促进干细胞向成骨细胞系分化。此外，它能够很容易地官能化以结合生物分子诱导和调控干细胞的行为。虽然还存在一些挑战，但利用石墨烯诱导成骨分化的进一步研究成果值得期待。这些挑战之一是我们并未更加全面而深刻的了解石墨烯刺激干细胞的分化机制与信号通路等。此外，一定不可忽视石墨烯在活体试验中的效果，还需要在动物体内做深入的研究以评估材料对组织及器官的相互作用机制，允许未来的临床应用。

由于独特的结构和优异的性能，石墨烯及其衍生物对于生物医学应用有着巨大的潜力，但是，石墨烯生物技术领域正处于起步阶段，还有更多的性能有待发现，为将来在不同研究领域的重大应用提供广阔的空间。

[1] Bae H,Chu H,Edalat F,et al.Development of functional biomaterials with micro-and nanoscale technologies for tissue engineering and drug delivery applications[J].J Tissue Eng Regen Med,2014,8(1):1-14

[2] Rosa V,Della Bona A,Cavalvanti BN,et al.Tissue engineering:from research to dental clinics[J].Dent Mater,2012,28(4):341-348

[3] Rosa V,Zhang Z,Grande RH,et al.Dental pulp tissue engineering in full-length human root canals[J].J Dent Res,2013,92(11):970-975

[4] Lee C,Wei X,Kysar JW,et al.Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayer graphene[J].Science,2008,321(5887):385-388

[5] Kostarelos K,Novoselov KS.Materials science.Exploring the interface of graphene and biology[J].Science,2014,344(6181):261-263

[6] Goenka S,Sant V,Sant S.Graphene-based nanomaterials for drug delivery and tissue engineering[J].J Control Release,2014,173:75-88

[7] Liu J,Cui L,Losic D.Graphene and graphene oxide as new nanocarriers for drug delivery applications[J].Acta Biomater,2013,9(12):9243-9257

[8] Depan D,Misra RD.The interplay between nanostructured carbon-grafted chitosan scaffolds and protein adsorption on the cellular response of osteoblasts:structure-function property relationship[J].Acta Biomater,2013,9(4):6084-6094

[9] Wells DB,Belkin M,Comer J,et al.Assessing graphene nanopores for sequencing DNA[J].Nano Lett,2012,12(8):4117-4123

[10]Zhang M,Yin BC,Tan W,et al.A versatile graphenebased fluorescence"on/off"switch for multiplex detection of various targets[J].Biosens Bioelectron,2011,26(7):3260-3265

[11]Alzahrani AZ,Srivastava GP.Gradual changes in electronic properties from graphene to graphite:first-principles calculations[J].J Phys Condens Matter,2009,21(49):495503

[12]Bunch JS,Verbridge SS,Alden JS,et al.Impermeable atomic membranes from graphene sheets[J].Nano Lett,2008,8(8):2458-2462

[13]Nair RR,Blake P,Grigorenko AN,et al.Fine structure constant defines visual transparency of graphene[J].Science,2008,320(5881):1308

[14]Pinto AM,Goncalves IC,Goncalves FD.Magalhaes,Graphene-based materialsbiocompatibility:a review[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2013,111:188-202

[15]Novoselov KS,Geim AK,Morozov SV,et al.Electric field effect in atomically thin carbon films[J].Science,2004,306(5696):666-669

[16]Kim SM,Kim JH,Kim KS,et al.Synthesis of CVD-graphene on rapidly heated copper foils[J].Nanoscale,2014,6(9):4728-4734

[17]Elkhenany H,Amelse L,Lafont A,et al.Graphene supports in vitro proliferation and osteogenic differentiation of goat adult mesenchymal stem cells:potential for bone tissue engineering[J].J Appl Toxicol,2015,35(4):367-374

[18]Yang K,Wan J,Zhang S,et al.In Vivo Pharmacokinetics，Long-Term Biodistribution,and Toxicology of PE Gylated Graphene in Mice[J].ACS Nano,2011,5(1):516-522

[19]Santos CM,Mangadlao J,Ahmed F,et al.Graphene nanocomposite for biomedical applications:fabrication,antimicrobial and cytotoxic investigations[J].Nanotechnology,2012,23(39):395101

[20]Liu S,Zeng TH,Hofmann M,et al.Antibacterial activity of graphite,graphite oxide,graphene oxide,and reduced graphene oxide:membrane and oxidative stress[J].ACS Nano,2011,5(9):6971-6980

[21]Gurunathan S,Han JW,Dayem AA,et al.Oxidative stressmediated antibacterial activity of graphene oxide and reduced graphene oxide in Pseudomonas aeruginosa[J].Int J Nanomedicine,2012,7:5901-5914

[22]Hu WB,Peng C,Luo W,et al.Graphene-based antibacterial paper[J].ACS Nano,2010,4(7):4317-4323

[23]Lu B,Li T,Zhao H,et al.Graphene-based composite materials beneficial to wound healing[J].Nanoscale,2012,4(9):2978-2982

[24]Mejias Carpio IE,Santos CM,Wei X,et al.Toxicity of a polymer-graphene oxide composite against bacterial planktonic cells,biofilms,and mammalian cells[J].Nanoscale,2012,4(15):4746-4756

[25]Sahoo NG,Bao H,Pan Y,et al.Functionalized carbon nanomaterials as nanocarriers for loading and delivery of a poorly water-soluble anticancer drug:a comparative study[J].Chem Commun(Camb),2011,47(18):5235-5237

[26]Zhang L,Xia J,Zhao Q,et al.Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs[J].Small,2010,6(4):537-544

[27]Kim H,Namgung R,Singha K,et al.Graphene oxidepolyethylenimine nanoconstruct as a gene delivery vector and bioimaging tool[J].Bioconjug Chem,2011,22(12):2558-2567

[28]Wei G,Yan M,Dong R,et al.Covalent modification of reduced graphene oxide by means of diazonium chemistry and use as a drug-delivery system[J].Chemistry,2012,18(46):14708-14716

[29]Yin D,Li Y,Lin H,et al.Functional graphene oxide as a plasmid-based Stat3 siRNA carrier inhibits mouse malignant melanoma growth in vivo[J].Nanotechnology,2013,24(10):105102

[30]Wang Y,Huang R,Liang G,et al.MRI-visualized,dualtargeting,combined tumor therapy using magneticgraphenebased mesoporous silica[J].Small,2014,10(1):109-116

[31]Liu G,Shen H,Mao J,et al.Transferrin modified graphene oxide for glioma-targeted drug delivery:in vitro and in vivo evaluations[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(15):6909-6914

[32]Zhi F,Dong H,Jia X,et al.Functionalized graphene oxide mediated adriamycin delivery and miR-21 gene silencing to overcome tumor multidrug resistance in vitro[J].PLoS One,2013,8(3):e60034

[33]Tomei S,Wang E,Delogu LG,et al.Non-BRAF-targeted therapy,immunotherapy,and combination therapy for melanoma[J].Expert Opin Biol Ther,2014,14(5):663-686

[34]Kuzum D,Takano H,Shim E,et al.Transparent and flexible low noise graphene electrodes for simultaneous electrophysiology and neuroimaging[J].Nat Commun,2014,5:5259

[35]Li N,Zhang X,Song Q,et al.The promotion of neurite sprouting and outgrowth of mouse hippocampal cells in culture by graphene substrates[J].Biomaterials,2011,32(35):9374-9382

[36]Depan D,Girase B,Shah JS,et al.Structure-process-property relationship of the polar graphene oxide-mediated cellular response and stimulated growth of osteoblasts on hybrid chitosan network structure nanocomposite scaffolds[J].Acta Biomater,2011,7(9):3432-3445

[37]Tian Q,Liu H.Electrophoretic deposition and characterization of nanocomposites and nanoparticles on magnesium substrates[J].Nanotechnology,2015,26(17):175102

[38]Porwal H,Grasso S,Cordero-Arias L,et al.Processing and bioactivity of 45S5 Bioglass((R))-graphene nanoplatelets composites[J].J Mater Sci Mater Med,2014,25(6):1403-1413

[39]秦 汉,王 剑,杨 涛,等.石墨烯/壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏凝胶的制备及其性能评价[J].口腔颌面修复学杂志,2016,17(5):257-262

[40]Wang Y,Lee WC,Manga KK，et al.Fluorinated graphene for promoting neuro-induction of stem cells[J].Adv Materials,2012,24(31):4285-4290

[41]Chen GY,Pang DW,Hwang SM,et al.A graphene-based platform for induced pluripotent stem cells culture and differentiation[J].Biomaterials,2012,33(2):418-427

[42]Nayak TR,Andersen H,Makam VS,et al.Graphene for controlled and accelerated osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].ACS Nano,2011,5(6):4670-4678