复方七芍降压片保护自发性高血压大鼠血管内皮损伤的作用研究*

蔺晓源刘 丹曾 勇

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208）

·研究报告·

复方七芍降压片保护自发性高血压大鼠血管内皮损伤的作用研究*

蔺晓源1，2刘 丹1曾 勇1

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208）

目的探讨复方七芍降压片保护自发性高血压大鼠（SHR）血管内皮损伤的作用机制。方法 将30只SHR大鼠根据体质量按随机数字表法分为模型组、复方七芍降压片组和厄贝沙坦片组，每组各10只。另取10只Wistar-kyoto（WKY）大鼠为正常组；给药6周后，采用ELISA检测血清中生长素（Ghrelin）、一氧化氮合酶（NOS）和内皮素-1（ET-1）的含量变化，RT-PCR测定胸主动脉Ghrelin受体（GHSR）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA表达。结果模型组血清Grelin、NOS含量和胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达降低，血清ET-1含量升高，与正常组比较差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。复方七芍降压片组和厄贝沙坦组上述指标均较模型组有不同程度的改善 （P＜0.05或P＜0.01），且复方七芍降压片组对血清Ghrelin、NOS、ET-1含量和胸主动脉eNOS mRNA表达的影响优于厄贝沙坦组（P＜0.05）。结论复方七芍降压片可能通过调节Ghrelin、NO、ET-1含量及GHSR、NOS的基因表达而起保护SHR大鼠血管内皮损伤的作用。

复方七芍降压片 自发性高血压大鼠 生长素 血管内皮活性物质

近年来随着生物医学的发展和深化，人们认识到原发性高血压（EH）患者存在内皮依赖性血管舒张功能失调。因而逆转血管内皮功能已成为EH治疗的新靶点，寻找具有内皮细胞保护作用的药物则成为治疗的关键。生长素（Ghrelin）是内源性生长激素促分泌素受体（GHSR）的内源性配体，对心血管系统具有直接作用，能明显降低血压水平［1］。目前Ghrelin与EH发生发展的相互关系已成为国内外研究的热点之一，而对于Ghrelin在EH血管内皮功能中的具体作用如何，尚存在争议。针对EH“虚、瘀、风”的中医病机，采用养阴柔肝、化瘀息风的复方七芍降压片干预，能安全有效地降低患者血压、改善临床症状［2］。因此，为了进一步探讨复方七芍降压片治疗EH的作用机制，我们观察了其对自发性高血压大鼠（SHR）大鼠Ghrelin及血管内皮活性物质一氧化氮合酶（NOS）和内皮素（ET-1）的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄SPF级SHR大鼠30只、Wistarkyoto（WKY）大鼠10只，雄性，体质量240~280 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司 ［SCXK（沪）2012-0002］提供。

1.2 药物 复方七芍降压片（湖南中医药大学第一附属医院制剂科生产，规格：0.4 g/片），以蒸馏水配置成浓度为43.2 mg/mL的混悬液；厄贝沙坦片（安来，浙江华海药业股份有限公司，国药准字H20030016，规格：75 mg/片），用蒸馏水配置成浓度为1.52 mg/mL的混悬液。

1.3 试剂与仪器 大鼠Grelin、NOS、ET-1 ELISA试剂盒 （美国RD公司），YBR Green PCR试剂盒（KAPA Biosystems），逆转录试剂盒（TAKARA）。Enspire多功能酶标仪 （美国Perkinelmer），Universal HoodⅡ凝胶成像系统 （美国Bio-rad），Realplex2荧光定量PCR仪（德国Eppendorf），Lynx6000落地式高速离心机（美国Thermo Fisher），Pureloab Classic UVF超纯水仪 （法国ELGA Labwater）。

1.4 分组与给药 将SHR大鼠根据体质量按随机数字表法分为模型组、复方七芍降压片组和厄贝沙坦组，每组10只，另设WKY大鼠为正常组。复方七芍降压片组动物灌胃复方七芍混悬液，厄贝沙坦组动物灌胃厄贝沙坦混悬液，灌胃剂量均为10 mL/kg，其他两组灌胃等容量蒸馏水。给药6周。

1.5 标本采集 各组大鼠末次给药后10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，置于冰盒上真空采血管心脏取血，4℃离心（3000 r/min）15 min，取上层血清置-20℃冰箱保存。取血后，迅速剪取小段胸主动脉组织，置于冻存管放入液氮中保存。

1.6 指标检测 1）ELISA检测血清中 Grelin、NOS、ET-1的含量变化，严格按照试剂盒操作步骤进行。2）RT-PCR测定胸主动脉GHSR、eNOS的mRNA表达，取待测组织，Trizol法进行总RNA提取和纯度分析。合成cDNA第一条链，将制备好的cDNA进行PCR扩增。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因引物GHSR上游5'-CTACGCCACGGTCCTCA-3'、下游5'-CTTCACGCGGCCCTTA-3'，eNOS上游5'-CGGCATCACCAGGAAGAAGA-3'、下游5'-CATGAGCGGCGGAGAT-3'，内参基因 β-Actin引物上游 5'-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'、下游5'-TAGGAGC C AGGGCAGTA-3'。数据采用仪器自带软件qbase plus进行分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。计量资料以（s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量比较 见表1。模型组大鼠血清Grelin、NOS含量降低、ET-1含量升高，与正常组比较差异有显著性统计学意义（P＜0.01）。复方七芍降压片组和厄贝沙坦组血清Grelin、NOS水平升高，ET-1水平降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），且复方七芍降压片组优于厄贝沙坦组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量变化比较（s）

表1 各组大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量变化比较（s）

与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与厄贝沙坦组比较，＃P＜0.05。下同。

2.2 各组大鼠胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达比较 见表2。模型组胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达均较正常组降低（P＜0.05或P＜0.01）；复方七芍降压片和厄贝沙坦均能上调GHSR、eNOS的mRNA表达，与模型组比较差异有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01），且复方七芍降压片对eNOS的表达优于厄贝沙坦组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达变化比较（s）

表2 各组大鼠胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达变化比较（s）

3 讨 论

2005年美国高血压学会（ASH）提出了高血压的新定义，改变了以往对于高血压仅从单纯的数值判断的标准，而是将概念扩展到了总的心血管危险因素，包括动脉粥样硬化、内皮细胞功能损害、高脂血症和心血管事件等［3］。血管内皮功能障碍在EH中普遍存在，一旦内皮细胞受损，通过测定其分泌血管活性物质的水平，可判断内皮细胞功能变化。Ghrelin是一个含有28个氨基酸的多肽，主要由胃黏膜分泌，受体分布于多种组织中，在小鼠的左心室、心房、主动脉等部位均发现有GHSR的存在［4］。诸多研究表明，Ghrelin在心血管系统中具有广泛的生理病理作用［1］。外周静脉注射大剂量Ghrelin可以降低血压而不升高心率［5］。霍昱吉等研究显示血浆Ghrelin水平与血压呈负相关［6］，且其基因多态性研究也证明了这一相关性的存在［7］。Ghrelin除对心血管系统有保护作用外，Ghrelin及其受体在人类微血管内皮细胞中也有表达［8］。Ghrelin治疗后血压下降的机制可能包括通过激活内皮功能导致血管舒张或对血管平滑肌的直接作用［9］。现有研究推测：Ghrelin可以抑制内皮细胞死亡，增加eNOS的表达，直接诱导NO合成（通过NOS间接反映），从而改善内皮功能，扩张外周血管［10-11］；Chrelin是ET-1的内源性拮抗剂，可显著抑制ET-1诱导的血管内皮损伤及血管收缩效应［12］。何云等研究表明，不同EH中医证型间内皮活性物质NO、ET-1存在着一定的变化规律，可作为中医高血压病辨证分型的客观化指标［13］。本研究结果显示，模型组大鼠血清Grelin、NOS含量降低、ET-1含量升高，胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达下降（P＜0.05），说明Ghrelin水平与EH血管内皮功能密切相关。

EH属中医学“眩晕”“头痛”等范畴，“阴虚阳亢、瘀血阻络”是其发病的基本病机，并可用“虚、瘀、风”来概括，治宜治虚、治瘀、治风相结合［14］。我们采用养阴柔肝、化瘀息风立法的医院制剂复方七芍降压片治疗效果确切。该方由三七、白芍、桑寄生、杜仲、丹参、天麻、萝芙木、地龙、葛根、炒香附、甘草组成。方中三七活血化瘀通络，白芍养阴柔肝息风，共为君药。桑寄生、杜仲补益肝肾，丹参活血祛瘀，天麻平肝息风，均为臣药。萝芙木平肝清热，地龙息风通络，葛根生津活血，炒香附理气疏肝，共为佐药。甘草为使，调和诸药。以上11味药合用，使阴虚得补、阳亢得平、脉络得畅、髓海得濡、清窍得养、眩晕自止。研究表明，复方七芍降压片能有效降低血压，其作用机制可能与改善血液高凝状态和逆转 SHR血管重塑有关［2，15］。本研究结果显示，复方七芍降压片能明显改善SHR大鼠血清Grelin、NOS、ET-1水平和胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达，表明复方七芍降压片对SHR大鼠血管内皮的保护作用可能与调节Ghrelin和血管内皮活性物质水平密切相关。而复方七芍降压片对血清Ghrelin、NOS、ET-1含量和胸主动脉eNOS mRNA表达优于厄贝沙坦组，可能与中药复方的多靶点效应有关。以上研究不但揭示了复方七芍降压片治疗EH的作用靶点，也为Ghrelin在血管内皮损伤中的作用提供了一定依据。

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Study on the Protective Effect of Fufangqishao Anti-hypertension Tablets on Vascular Endothelial Injury in Spontaneously Hypertensive Rats

LIN Xiaoyuan，LIU Dan，ZENG Yong. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective：To explore the protective effect of Fufangqishao anti-hypertension tablets（FHT）on vascular endothelial injury in spontaneously hypertensive rats.Methods：30 SHR rats were randomly divided into model group，FHT group and irbesartan group.Another 10 Wistar-kyoto（WKY）rats were taken as the normal group.After 6 weeks of treatment，ELISA was used to detect the levels of serum Ghrelin，NOS and ET-1.The mRNA expression of GHSR，eNOS in the thoracic aorta were measured by RT-PCR.Results：Compared with the normal group，the levels of serum Ghrelin，NOS and the mRNA expression of GHSR，eNOS in the thoracic aorta decreased，serum ET-1 content increased in the model group and the difference was statistically significant（P< 0.05 or P<0.01）.The indexes above in FHT group and irbesartan group had different degrees of improvement compared with the model group（P<0.05 or P<0.01）.The effects on serum Ghrelin，NOS，ET-1 content and eNOS mRNA expression in thoracic aorta in FHT group were better than that of irbesartan group（P<0.05）.Conclusion：FHT may regulate Ghrelin，NOS，ET-1 content and GHSR，eNOS gene expression to protect vascular endothelial injury in SHR rats.

Fufangqishao anti-hypertension tablets；Spontaneously hypertensive rats；Ghrelin；Vascular endothelial active substance

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2220-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.004

2016-08-20）

国家自然科学基金项目（81473616）；中医内科重大疾病防治研究及转化教育部重点实验室开放基金（ZYNK201403）