社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型及药敏结果

牛瑞兵，郭利平，王新刚，段宝生，巴特尔

(鄂尔多斯市中心医院，内蒙古 鄂尔多斯 017000)



·论著·

社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型及药敏结果

牛瑞兵，郭利平，王新刚，段宝生，巴特尔

(鄂尔多斯市中心医院，内蒙古 鄂尔多斯 017000)

目的 了解某院门诊和住院患者标本分离的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)盒式染色体基因(SCCmec)型别以及CA-MRSA耐药性。方法收集该院2011年5月—2015年8月分离的MRSA及其相关病史资料，利用聚合酶链反应(PCR)方法进行MRSA的mecA基因和CA-MRSA的SCCmec基因分型检测，对CA-MRSA进行药物敏感性试验并进行统计分析。结果共收集MRSA 305株，其中mecA阳性296株。CA-MRSA 88株，占29.73%(88/296)，其中48株为SCCmecⅣ型，36株为SCCmecⅤ型，4株未定型。药敏试验显示，CA-MRSA对万古霉素、利奈唑胺、替加环素均100%敏感，对青霉素和苯唑西林100%耐药；SCCmecⅣ和Ⅴ型CA-MRSA对左氧氟沙星、利福平、环丙沙星的耐药率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。SCCmecⅣ、Ⅴ型CA-MRSA对氨苄西林/舒巴坦、呋喃妥因、红霉素的耐药率均>58%。结论该院CA-MRSA的SCCmec分型以Ⅳ和Ⅴ型为主，且耐药率较高，临床医生应对此高度重视,根据药敏结果合理应用抗菌药物。

金黄色葡萄球菌； 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌； CA-MRSA； SCCmec基因分型； 抗药性，微生物； 耐药性； 合理用药

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：897-901]

1961年发现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)现在是社区获得性感染的重要病原菌，并且感染率有逐年上升的趋势[1]。与医院获得性MRSA(hospital-acquired MRSA，HA-MRSA)感染不同,社区获得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)感染通常发生在社区环境中，是导致皮肤及软组织获得感染的主要因素[2]。MRSA的耐药机制主要是获得了外源性葡萄球菌盒式染色体基因(staphylococcal cassette chromosomemec, SCCmec)，其携带mecA基因在内的多种耐药基因，SCCmec的结构具有高度多态性，可分为不同的型[3]。本研究利用多重聚合酶链反应(PCR)技术检测MRSA的mecA基因和CA-MRSA的SCCmec基因型，研究鄂尔多斯地区CA-MRSA的基因型及药物敏感情况，为预测发展趋势，控制暴发流行，治疗CA-MRSA感染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集鄂尔多斯市中心医院2011年5月—2015年8月门诊和住院患者微生物标本分离鉴定的MRSA 305株，所有菌株均为非重复菌株，同一患者同一部位只取1次分离株。MRSA的筛查用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪，所用质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923购于卫生部临床检验中心。用PCR方法检测mecA基因确定MRSA 296株。

1.1.2 CA-MRSA的诊断 符合以下条件的为CA-MRSA感染[3]：患者在门诊就诊时MRSA培养阳性或在入院48 h内MRSA培养阳性；患者无MRSA感染或定植的病史；患者在过去一年中无住院史，无外科手术史，无护理中心入住史，无透析史，患者无永久留置的管腔或经皮肤进入体内的医疗装置。

1.1.3 主要试剂及仪器 细菌基因组提取试剂盒、溶葡球菌酶、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、100 bp DNA Ladder、琼脂糖、核酸染料均购于南京博尔迪生物科技有限公司。实验所有引物序列由上海生工生物工程技术有限公司合成。BioRad公司PCR扩增仪(PTC-200)，北京六一仪器厂DYY-6C型电泳仪，英国Syngene公司电泳成像分析系统。法国VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪及药敏系统，药敏卡及培养基全部购于北京威泰科生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MRSA基因组DNA模板提取 将已冻存的菌株重新接种于哥伦比亚血平板上，置37℃温箱中孵育18～24 h。用灭菌环从血平板上挑取8～10个复活菌落置于300 μL含溶葡球菌酶液中，置37℃温箱中水浴30 min，取出放入100℃沸水中小火煮10 min，12 000 r/mim离心5 min，其余方法按照细菌DNA提取试剂盒的操作进行，提取DNA置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2mecA基因检测 参照文献[4]合成mecA基因扩增引物:MECAP4：5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’，MECAP7：5’-CCACTTCATATCTTGTAAGG-3’，扩增片段大小约为162 bp。采用PCR方法对初筛的MRSA进行分子学检测，携带mecA基因的确定为MRSA菌株。PCR扩增体系为25 μL，其中DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，MECAP40.25 μL，MECAP70.25 μL，余ddH2O补足。PCR扩增条件为94℃初变性4 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸4 min，1.5%琼脂糖电泳，EB染色，紫外凝胶成像仪观察目的条带，并拍照成像。

1.2.3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型 参照2007年Milheirico等[5]方法设计10对引物，采用多重PCR的方法对CA-MRSA菌株进行SCCmec基因分型，所用引物见表1。反应体系为25 μL，其中DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，各种引物的最终浓度和用量参考文献，余ddH2O补足。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸7 min。取10 μL PCR产物点样，在 1.8%琼脂糖凝胶中电泳1 h，结果拍照保存。

1.2.4 药物敏感试验 采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统对分离的CA-MRSA进行16种抗菌药物的敏感性试验。结果判定采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)2005年版标准进行。

1.3 统计学分析 所收集数据应用WHONET 5.2软件和SPSS 15.0统计软件进行分析，CA-MRSA SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型耐药率比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

表1 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型所用引物

2 结果

2.1 CA-MRSA标本来源 根据临床诊断共获得88株CA-MRSA，来自于皮肤科、骨科、普通外科、儿科、肿瘤科、重症监护病房(ICU)、神经外科等12个科室，其中以儿科、皮肤科和骨科所占比率最高。见图1。

图1 88株CA-MRSA来源科室分布

2.2 MRSA菌株多重PCR鉴定结果 经多重PCR扩增，扩增产物凝胶电泳图成像显示，305株MRSA 中mecA基因阳性296株。见图2。

2.3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型结果 利用多重PCR方法对88株CA-MRSA进行SCCmec基因分型，48株为SCCmecⅣ型，36株为SCCmecⅤ型，4株未定型。见图3。

M: DNA ladder maker(100～1 500 bp)；1—11泳道：临床MASA菌株；-:阴性对照

图2mecA基因PCR扩增产物电泳图

Figure 2 Electrophoresis map of PCR amplification products ofmecA gene

M: DNA ladder maker(100～1 500 bP)；1—15：CA-MRSA菌株；-:阴性对照；其中1、2泳道菌株SCCmec分型未定型，3、4、9、10号菌株为SCCmecⅤ型，5—8、11—15号菌株为SCCmecⅣ型

图3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型电泳图

Figure 3 Electrophoresis map of CA-MRSA SCCmecgenotyping

2.4 CA-MRSA药敏结果 84株SCCmec分型的CA-MRSA对万古霉素、利奈唑胺、替加环素均100%敏感，对青霉素和苯唑西林100%耐药；SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA对左氧氟沙星、环丙沙星、利福平的耐药率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，对其余9种抗菌药物的耐药率均相对较高。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA对氨苄西林/舒巴坦的耐药率分别为66.67%、69.44%，对呋喃妥因的耐药率分别为62.50%、58.33%，对红霉素的耐药率分别为66.67%，69.44%。见表2。

表2 不同SCCmec基因型CA-MRSA对抗菌药物的耐药情况[株(%)]

3 讨论

MRSA既是医院获得性感染，也是社区获得性感染的主要病原菌之一。虽然医疗技术在高速发展，但MRSA感染率及病死率一直居高不下。根据文献[6]报道，从20世纪90年代开始CA-MRSA感染在国内外的不同地区均十分严峻，甚至发生暴发流行。SCCmec基因分型是研究CA-MRSA菌株基因型变化或流行病学的最常用方法，也是区分HA-MRSA和CA-MRSA感染的一种重要检测方法[7]。

本研究显示，鄂尔多斯市中心医院门诊与病房标本分离的296株MRSA中，根据病史资料CA-MRSA为88株，占29.73%。感染标本主要来源于儿科和皮肤科、骨科，说明CA-MRSA主要感染儿童、健康人群，且以感染皮肤软组织为主。根据SCCmec分型主要分为两个型别，分别是SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型，其中SCCmecⅣ型48株，SCCmecⅤ型36株，与国内其他地区的文献[8]报道结果基本一致。而李敏豪等[9]的研究表明，CA-MRSA的SCCmec分型为Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型，可能是由于地理区域不同，导致的CA-MRSA的基因分型有所不同，也可能是由于病史资料的统计方法不同，致使一部分HA-MRSA判断为CA-MRSA。本实验中的4株未定型CA-MRSA可能为SCCmec亚型，需要进一步鉴定。

MRSA耐药机制主要是由于编码青霉素结合蛋白(PBPs)的基因发生变化所致。MRSA的多重耐药特点与拥有的SCCmec结构存在联系。SCCmec主要有5个型别, HA-MRSA基因型别为SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型, CA-MRSA 基因型别多为Ⅳ型和Ⅴ型。SCCmec基因型与 MRSA 的流行背景有关, 不同地区的 SCCmec可能不同, 不同遗传背景的克隆株携带的 SCCmec也可能不同，同时耐药也存在显著差异[10]。HA-MRSA通常多重耐药严重，对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、林可霉素等多种抗菌药物耐药，通常仅对糖肽类敏感，目前万古霉素是其最后一道防线[11]。CA-MRSA除mecA基因外很少携带其他耐药基因，但随着抗菌药物的频繁使用，CA-MRSA对各类抗菌药物的耐药性也在不断增强。

本研究显示，84株CA-MRSA对青霉素和苯唑西林100%耐药，但未发现对万古霉素、利奈唑胺、替加环素的耐药菌株。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA对左氧氟沙星、环丙沙星、利福平的耐药率比较，差异有统计学意义，且耐药率比较低，对其余9种抗菌药物的耐药率均无差别，且耐药率相对偏高。说明不同的SCCmec基因型别的菌株对抗菌药物的耐药性有一定的差别，可能是由于不同的SCCmec基因携带了不同的耐药基因所致[12]。在美国，克林霉素是皮肤软组织感染门诊治疗的推荐用药[13]，而本地区克林霉素耐药率高达50%，说明在门诊治疗中要根据具体情况选择合适的抗菌药物。本实验中Ⅳ型和Ⅴ型CA-MRSA对大多数抗菌药物的耐药率均较刘小丽等[8]的研究要高，对氨苄西林/舒巴坦的耐药率分别为66.67%、69.44%，对呋喃妥因的耐药率分别为62.50%、58.33%，对红霉素的耐药率分别为66.67%，69.44%，说明本地区CA-MRSA的耐药性比较严重。在临床治疗CA-MRSA感染过程中可联合使用耐药率较低的左氧氟沙星、环丙沙星、利福平，防止耐药率的升高，同时不宜根据经验用药，要根据实验室的药物敏感性合理应用抗菌药物。

综述所述，本院CA-MRSA感染流行较严重，耐药率较高，临床医生应引起高度重视。

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(本文编辑：左双燕)

SCC mec genotyping and antimicrobial susceptibility of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus

NIURui-bing,GUOLi-ping,WANGXin-gang,DUANBao-sheng,BATe-er

(OrdosCentralHospital,Ordos017000,China)

Objective To investigate the types of staphylococcal cassette chromosomemec(SCCmec) gene and antimicrobial resistance of community-acquired methicillin-resistantStaphylococcusaureus(CA-MRSA) isolated from outpatients and inpatients in a hospital.Methods MRSA strains isolated between May 2011 and August 2015 in a hospital and the relevant case data were collected, polymerase chain reaction(PCR) method was used to identifymecA gene of MRSA and SCCmecgene of CA-MRSA, antimicrobial susceptibility testing of CA-MRSA were performed and analyzed.Results A total of 305 MRSA isolates were collected, 296 of which weremecA positive, 29.73%(88/296) were CA-MRSA. The genotyping of CA-MRSA showed that 48 strains were SCCmectype Ⅳ, 36 were SCCmectype V, the other 4 strains were undefined. Antimicrobial susceptibility testing results showed that susceptibility rates of CA-MRSA to vancomycin, linezolid, and tigecycline were all 100%, resistance rates to penicillin and oxacillin were both 100%; resistance rates of SCCmectype IV and SCCmectype V CA-MRSA strains to levofloxacin, rifampicin, and ciprofloxacin were all significantly different (allP<0.05), to ampicillin/sulbactam, furantoin, and erythromycin were all >58%.Conclusion The main SCCmectype of CA-MRSA are type IV and type V in this hospital, antimicrobial resistance rate is high, clinicians should pay high attention, and use antimicrobial agents according to antimicrobial susceptibility testing results.

Staphylococcusaureus; community-acquired methicillin-resistantStaphylococcusaureus; CA-MRSA; SCCmecgenotyping; drug resistance, microbial; rational antimicrobial use

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.001

2016-06-25

内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2013MS1116)；内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目(201302161)

牛瑞兵(1986-)，男(汉族)，山西省兴县人，主管检验师，主要从事微生物与免疫学疾病的研究。

段宝生 E-mail:erdsdbs@163.com

R378.1+1 R969.3

A

1671-9638(2016)12-0897-05