胶质母细胞瘤DNA甲基化研究进展

康恩铭 章薇 章翔

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

·综述·

胶质母细胞瘤DNA甲基化研究进展

康恩铭 章薇*章翔*

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

胶质母细胞瘤; DNA甲基化; 基因分型

胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是恶性程度最高、最具侵袭性的中枢神经系统肿瘤，其发生率约占胶质瘤的69%[1]。目前，GBM的标准治疗是在确保安全的情况下最大范围地予以手术切除肿瘤，随后给予化疗与放疗的联合治疗[2]。但是，即便采取最激进的治疗方法， GBM患者的生存时间仍然很短。在我国，低级别胶质瘤(WHO Ⅰ～Ⅱ级)的中位生存期为78.1月，而GBM只有14.4个月[3]。

近20年来，随着分子生物学技术的发展，尤其是高通量测序和基因组测序的应用，使从全基因组水平评价各类肿瘤的遗传学和表观遗传学改变成为可能。细胞和分子遗传学研究已经证实，在GBM中存在大量的染色体异常和基因变异。目前，原发性GBM根据其基因改变被分为：神经元型、前神经元型、经典型及间质型四种。但是，除了基因改变，表观遗传学改变也可能包含在每种亚型的发展和演进之中[4]。作为表观遗传学调控的重要机制之一，DNA甲基化对GBM的发生与演进也具有重要作用。现将近期内GBM的DNA甲基化的研究进展进行回顾与综述。

一、胶质瘤CpG岛甲基化表型

随着应用高通量平台进行基因组范围的DNA甲基化分析技术的成熟，建立大样本量患者甲基化组已经成为可能[5]。CpG岛(CpG island)甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP) 最早是通过对一组结肠癌患者的CpG岛甲基化模式进行分析中而提出的[6]。随后，Noushmehr等[7]在胶质瘤中也观察到其特有的甲基化表型，美国癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas, TCGA)将其命名为胶质瘤CpG岛甲基化表型(glioma-CpG island methylator henotype，G-CIMP)。他们认为G-CIMP阳性亚群的胶质瘤多具有前神经元型GBM的特点，并且预后更好。G-CIMP阳性与IDH1(isocitrate dehydrogenase 1)突变与患者的年龄有很强的相关性，并且大多缺乏在GBM中经常出现的表皮生长因子受体扩增、7号染色体扩增和10号染色体缺失等特点。随后Turcan等[8]确认了G-CIMP的分子基础，他们认为IDH1基因突变可以通过改变特异性的组蛋白标记(如大量的DNA超甲基化)来形成G-CIMP。这些IDH1突变使得某些关键的基因表达程序发生表观遗传学变化，进而使G-CIMP阳性GBM表现出前神经元型GBM而不是其他类型的特点。Mazor等[9]在分析GBM患者的DNA甲基化表型与肿瘤复发的关系时认为，复发的肿瘤都有相似的G-CIMP表型，并且这种G-CIMP表型在复发后也一直保持，提示这些表观遗传学改变一般出现较早，并且很有可能与肿瘤的发生与发展有关。

二、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动子甲基化

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)是GBM中另一个DNA甲基化状态变化直接左右临床治疗的例子。MGMT是一种DNA错配修复酶，能够特异性地移除O-6鸟嘌呤位点上的甲基基团，修复替莫唑胺(temozolomide, TMZ)引发的DNA损伤，从而降低肿瘤对TMZ化疗的敏感性，其基因位于染色体10q26[10]。MGMT启动子的甲基化状态与使用TMZ化疗的GBM患生存时间密切相关，是预测治疗反应的独立因素[5]。 Brennan等[11]对500多例GBM病例的基因组甲基化进行了多维综合性分析，同时将MGMT启动子甲基化状态与患者生存时间进行关联性研究，他们证明MGMT启动子甲基化状态可以区分经典型GBM患者的预后情况(n=96;P=0.01)，但是无法区分前神经元型(n=66;P=0.57)、间质型(n=104;P=0.62)和神经元型(n=55;P=0.12)。另外，MGMT启动子甲基化在G-CIMP阳性GBM患者中的出现率要高于G-CIMP阴性患者。与此同时，和MGMT启动子甲基化类似，MGMT基因体的甲基化也会对患者的生存时间造成影响[11]。Mur等[12]在对247例胶质瘤患者进行DNA甲基化状态分析后，证实MGMT基因体的甲基化状态与65岁以上患者的生存期相关。另外，他们还确认了2个不同甲基化状态影响胶质瘤患者生存的MGMT基因相关的CpG区域，这两个区域发生甲基化意味着患者具有更长的生存时间。但是，这种现象仅仅出现在G-CIMP阳性的患者中，在G-CIMP阴性患者中并不成立。由此可以推测，MGMT基因相关甲基化对胶质瘤患者的生存影响并不仅仅局限在影响烷化剂化疗药物治疗的敏感性上，而是可以与其他因素协同而产生更广泛的生物学效应，这些协同因素很可能就包含在G-CIMP位点之中。陈蔚军等[13]在研究YKL-40对胶质瘤干细胞增殖、侵袭以及“干性”维持的作用时，总结出MGMT高表达条件下，胶质瘤干细胞内的YKL-40能发挥促瘤作用。但是，MGMT与YKL-40的生物学特性之间并无直接联系，提示某种低甲基化表型促使MGMT高表达与特定分子的生物学特性产生了关联。

三、年龄相关DNA甲基化

年龄一直被认为是是GBM患者预后不良的独立预测因子[14]，其具体机制不明。Bozdag等[15]对TCGA中GBM患者的基因与外显子表达、复制拷贝数改变、单核苷酸多肽性 (single nucleotide polymorphisms, SNP)、全外显子组序列和DNA甲基化数据进行整合，以研究年龄特异性的转录水平、基因表达、表观遗传学状态的特点。统计学分析结果提示高年龄GBM患者常出现多梳蛋白家族的靶DNA高甲基化、以及血管生成相关基因表达上调。这些年龄相关性的改变，与其分子遗传学分型多无关联[15]。

四、DNA低甲基化

广泛的DNA低甲基化在GBM中属于通常性事件。在动物试验中，诱导小鼠广泛DNA低甲基化可以引起基因组不稳定、并诱发肿瘤形成。GBM的每单倍体基因组至少有1千万个CpG双核苷酸受到DNA低甲基化影响[16]，低甲基化的位点包括1号和16号染色体着丝粒周围的卫星序列2(satellite 2, Sat 2) 、染色体4q和10q端粒近段区域重复序列D4Z4和点缀的ALU元件。而严重的Sat2序列去甲基化常伴随着附近常染色质拷贝数的改变，提示低甲基化可能是引起GBM基因改变的前提因素之一。Lai等[17]研究GBM与正常脑组织的全基因组范围的甲基化差别时，分辨出至少1548个异常甲基化CpG位点(1307个基因)，其中低甲基化的基因要比高甲基化基因多2倍以上。对发生频率排名前十的低甲基化基因进行通路分析后提示，这些基因都是与固有免疫及获得性免疫功能相关的基因。Nagarajan等[18]在追踪了不同分子分型的G-CIMP阴性GBM的端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)和肿瘤蛋白p73 (tumour protien p73, TP73)基因的甲基化情况后，认为基因启动子低甲基化事件，可以明显地增强相应基因的转录活性。低甲基化协同组蛋白H3K4(lysine 4 on histone H3 protein)三甲基化，可以通过激活正常情况下被沉默的基因启动子来改变GBM瘤全局的转录环境，从而引起多种癌基因的表达。针对DNA低甲基化是否能判断GBM预后并作为潜在的诊断指标，Chen等[19]用亚硫酸盐测序法对比了GBM患者瘤组织切片、肿瘤患者血清、正常人血清的ALU低甲基化状态水平，证实肿瘤组织切片和肿瘤患者血清中ALU低甲基化状态有明显相关关系，并且其去甲基化程度高于正常人血清值，而低级别胶质瘤组的瘤组织和血清样本的ALU低甲基化水平要高于高级别(WHO Ⅲ～Ⅳ级)胶质瘤组。同时，他们还通过受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve, ROC)分析证实了过度低甲基化水平和短生存时间具有相关关系。

五、MicroRNA启动子甲基化

MicroRNA是一族长度约22个核苷酸的高度保守的非编码单链小RNA，可以通过抑制mRNA转录或诱导mRNA降解来干扰基因表达。MicroRNA对调控GBM的增殖、侵袭和迁移能力有着重要作用[20]。很多microRNA的启动子位于CpG岛中，因此其表达同样受到DNA甲基化的调控。mir-126是GBM中的抑癌microRNA，崔宏伟等[21]利用基因芯片研究了50例GBM患者，他们观察到正常脑组织中抑癌mir-126表达水平高于GBM组，而高级别GBM的mir-126表达则低于低级别GBM。这种与肿瘤病理级别相关的mir-126表达趋势与其启动子甲基化水平成正相关，但与患者的年龄、病理类型和性别没有关联。mir-153是另一个由于启动子甲基化引起表达下调的抑癌microRNA[22]。给予去甲基化试剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dC)处理可以使其表达上调，进而抑制胶质瘤的生长。 Zhou等[23]通过下调GBM细胞DNA甲基转移酶-1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)表达或给予5-aza-dC处理，可以降低mir-20启动子的甲基化水平，进而上调mir-20的表达。这两种均处理可以增加U251细胞系对替莫唑胺的治疗敏感性，提示改变某些microRNA启动子甲基化状态可以改善GBM的治疗效果。

六、展望

随着对GBM的DNA甲基化认识的不断加深，DNA甲基化对GBM发生、发展的重要性越来越受到关注。表观遗传学调控具有复杂性、多变性、时空特异性等特点，这给表观遗传学调控的研究带来了很大困难。现阶段学者们对DNA甲基化的研究大多局限在使用药物处理或者敲除DNA甲基转移酶，来观察某些基因改变对其下游靶点的影响。但是，GBM的表观遗传学改变涉及范围广，这类研究结果对改善GBM的治疗往往收效甚微。未来，如果能够找到调控表观遗传学变化的上游机制，从根源纠正GBM的整体表观遗传学改变，将对GBM的治疗产生深刻的影响。另外，虽然G-CIMP等表型分类对于患者的治疗分组和预后判短有很好的应用价值，但是由于全基因组甲基化检测费用昂贵，临床上较难对大量GBM患者进行全基因组甲基化组分析。因此，降低相应检测成本或者寻找一种替代分类法显得尤为急切和重要。随着基因编辑手段的成熟和对人类基因组信息挖掘的深入，越来越多的曾经认为没有意义的基因已经被发现其新的功能和作用，例如长链非编码RNA等，而探究表观遗传学调控对这类基因表达的影响也是未来的研究热点方向之一。总之，深入研究DNA甲基化对完善表观遗传学调控机制、理解GBM的生物学特性、精确地选择治疗方法、判断预后、设计临床实验分组和研制治疗靶点，均具有很重要的意义，将为攻克GBM的治疗带来深远的影响。

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R 739.41

A

1671-2897(2017)16-279-03

国家自然科学基金资助项目(81302174, 81672909)

康恩铭，硕士研究生，E-mail: kynself@aliyun.com

*通讯作者：章薇，副教授，硕士生导师，E-mail: nuomi_weiwei@126.com; 章翔，教授、主任医师，博士生导师，E-mail: xzhang@fmmu.edu.cn

2016-12-22；

2017-02-10)