miR-26a促骨再生机制及其应用研究进展

杨雅婷 综述 于子优 张文杰 审校

miR-26a促骨再生机制及其应用研究进展

杨雅婷 综述 于子优 张文杰 审校

诱导自身骨再生是修复大面积骨缺损的理想手段。miRNAs作为一种转录后水平的调控因子，能够调控一系列靶基因的表达。研究表明，miRNA-26a（miR-26a）能够同时促进与成骨-成血管相关的多个关键生长因子的表达，进而促进间充质干细胞成骨分化和骨再生。阐明miR-26a在干细胞成骨分化中的具体分子机制，有助于开发促进骨组织再生修复的新靶点。本文就目前miR-26a促进间充质干细胞成骨分化的调控机制和应用进展进行综述。

miR-26a 间充质干细胞 成骨分化

骨创伤或骨肿瘤等引起的大面积骨缺损，理想的修复方法是诱导自身骨再生。近年来，干细胞技术的发展使得利用多种来源间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）分化成骨变为可能。传统的促进MSC成骨分化的方法为添加成骨相关调节因子，如BMP2等，虽能够促进骨再生，但存在添加物降解过快以及难以控制再生程度等问题。此外，外源性干预手段可能会打破骨重建过程中骨形成与骨吸收之间的平衡，以及血管新生与血管改建之间的平衡，从而导致过量新生骨生长，也有可能因大量不成熟的血管形成而造成血管高压及血管微渗漏[1-2]。开发促进骨组织再生修复的新靶点，在最大程度上模拟自然状态下的成骨分化调控，已成为当前该领域研究的热点。

miRNA是由22个核苷酸组成的内源性非编码RNA分子，在转录后水平负向调控靶基因表达或阻遏翻译[3]。近年的研究表明，miRNA对成骨与成血管相关的转录因子和信号分子具有重要的调节作用[4]，与多种信号通路共同构成了干细胞成骨-成血管分化的调控网络[5-6]。研究认为，miR-26a能够调控多条成骨分化通路，同时促进内源性成骨-成血管相关的多个关键生长因子的表达，在不同来源的干细胞中发挥其促成骨分化潜能[7]。阐明miR-26a在干细胞成骨分化中的具体分子机制，有助于开发骨组织工程修复的新靶点。本文就目前miR-26a在促进干细胞成骨分化的调节通路方面的研究以及相关技术的应用进行综述。

1 miR-26a调控干细胞成骨分化的通路

miR-26a调控干细胞成骨分化的通路比较复杂，大致涉及 Sma-Mad族蛋白 1（SMAD1）、erbB2转录因子（transducer of ErbB2，Tob1）、WNT（Wg-int1）、糖原合成酶激酶 3β（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）等，不同研究应用了不同来源的MSC开展了探索[8-14]。

1.1 SMAD1

Luzi等[14]观察到人脂肪组织来源间充质干细胞（Humanadipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hADSCs） 在成骨分化过程中mir-26a表达增加，而SMAD1蛋白的表达则与之相反，通过2'-O-甲基-反义RNA能够增加SMAD1表达水平，使hADSCs中成骨标志基因上调，由此推测，mir-26a通过作用于SMAD1蛋白在hADSCs成骨分化过程中扮演重要角色。在另一项对hADSCs和骨髓来源间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs） 成骨分化的研究中，通过生物信息学预测和功能试验，明确了mir-26a通过潜在靶向性作用于GSK3β和Smad1来调节WNT和BMP信号通路。其中，综合比较分析显示，在ADSCs成骨分化中抑制Smad1以抑制BMP通路引起的干扰分化过程占主导[11]。此外，Luzi等在对调控SMAD1上游的Menin的研究中也报道了mir-26a参与的调节过程。Menin是多发性内分泌腺瘤致病因子 1（Multiple endocrine neoplasia 1，MEN1）抑癌基因的产物，具有广泛调节转录的功能[15]。通过采用荧光素酶表达质粒pGL3/miR-26a，证实了Menin-miR-26a的特异性相互作用，通过小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）将hADSCs中MEN1沉默会引起miR-26a的下调，最终导致SMAD1蛋白的上调，进一步分析发现，随着mir-26a的减少SMAD1蛋白出现上调，证明SMAD1是mir-26a在hADSCs成骨分化中的直接靶点[10]。分析hADSCs成骨分化阶段Menin及其mRNA的表达，两者都有所上升，与成骨标记基因如RUNT相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙素（Osteocalcin，OCN）等平行变化。 染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）分析显示，Menin占据miR-26a基因启动子，因而诱导它的表达，明确了Menin是一种miR-26a的正向调节因子。这些研究证实，Menin转录因子和miR-26a之间有直接相互作用，这在hADSCs成骨过程中可能起到关键作用，为miRNAs在骨疾病中的治疗提供了一个新的靶点。研究表明，在地塞米松诱导的hADSCs成骨分化过程中，Menin是一种对miR-26a直接调控，对SMAD1蛋白间接调控（通过miR-26a）的调控因子[16]。

1.2 Tob1

李岩等在卵巢摘除（Ovariectomy，OVX）骨质疏松疾病模型中发现，miR-26a通过功能性的靶向作用于Tob1，逆转了OVX-MSC的成骨能力缺陷。在OVX-MSC中上调miR-26a的表达，使成骨分化的关键性生长因子碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）OCN表达增高，预测 Tob1的非编码区（3‘UTR）存在miR-26a的结合位点。将OVX-MSC与Sham-MSC成骨诱导分化后，观察到在两种细胞中Tob1的表达均呈现逐渐降低的趋势。将建立的野生型或突变型的报告基因载体与miR-26a mimics共转染至MSC后，观察到miR-26a的过表达明显抑制了野生型Tob1报告基因载体的荧光素酶活性，而对突变型并无改变。同时，观察到miR-26a的过表达明显抑制Tob1蛋白在MSC中的表达，而对其基因表达无明显影响，细胞中成骨分化相关的关键性生长因子随Tob1表达的升高而明显下降[8]。该研究证明了miR-26a是通过功能性直接作用于Tob1，部分逆转了OVX-MSC的成骨能力缺陷。这种逆转能力在体内异位骨以及原位颅骨缺损修复中都得到了证实。此外，在对非限制性成体干细胞（Unrestricted somatic stem cells，USSC）成骨分化的研究中，生物信息靶向基因预测miR-26a抑制成骨的蛋白转录编码，随后证实Tob1也是靶点之一[13]。

1.3 WNT

miR-26a在WNT通路中的作用尚存在争议。在Su等[11]的研究中，通过生物信息和功能试验，明确了miR-26a通过潜在靶向性作用于GSK3β和Smad1来调节WNT和BMP信号通路。综合比较分析显示，WNT信号通路在BMSCs成骨分化中较BMP信号通路占主导，而后者在ADSCs成骨分化中起更大作用。这种分离的激活模式以及在信号通路中的作用，说明miR-26a主要靶向作用于GSK-3β以激活WNT信号通路，进而促进BMSCs的成骨分化，而在ADSCs成骨分化中则抑制Smad1，从而抑制BMP通路以干扰分化过程。但Li等[12]的研究认为，miR-26a-5p上调后通过直接靶向作用于Wnt5a的3＇非转录区（UTR）而抑制成骨分化，进而下调Wnt/Ca2+信号通路，生物数据算法提出Wnt5a的3＇UTR段是miR-26a-5p的潜在靶点，通过采用双荧光素酶报告基因分析和绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白（GFP/RFP）染色试验证实了这一预测，发现miR-26a-5p抑制Wnt5a，抑制钙离子流和蛋白激酶C，进而抑制ADSCs的成骨分化。相比之下，miR-26a-5p的抑制可以激活这些信号蛋白，促进成骨分化。

1.4 GSK-3β

有研究表明，Gsk-3β存在miR-26a的结合位点，而抑制GSK-3β可促进骨修复，显著提高OVX小鼠的矿物沉积率（Mineral apposition rate，MAR）和骨矿物质密度（Bone mineral density，BMD）[17-18]。为探究GSK-3β在调节成骨活性中的角色，沉默小鼠 MSCs和成骨细胞（Osteoblasts，Obs）中 GSK-3β的表达后，Runx2和OCN蛋白水平明显升高。通过添加miR-26a的模拟物和抑制剂，进一步验证miR-26a在其中的调节作用，结果表明，Runx2、OCN、Gsk-3β的表达在miR-26a过表达细胞中提高，在miR-26a抑制组中降低，证实了miR-26a通过功能性靶向作用于GSK-3β，上调成骨细胞活性[9]。ADSCs和BMSCs成骨分化的比较研究也证实，miR-26a主要靶向作用于GSK3β以激活WNT信号通路，进而促进BMSCs的成骨分化[11]。

1.5 其他

在miR-26a表达变化与成骨相关关键调节因子、成血管相关关键调节因子的表达关系的研究中发现，BMP2、RUNX2及OCN等与miR-26a的表达水平变化一致，通过碱性磷酸酶与茜素红染色观察到，miR-26a过表达有效促进了BMSC的磷酸酶活性与矿化能力。进一步研究发现，成骨相关关键调节因子（RUNX2，OCN）与成血管相关关键调节因子（血管内皮生长因子和血管生成素）在蛋白水平的表达也随着miR-26a表达的上调与下调而上升与下降[8]。上述结果表明，miR-26a体外可以在BMSCs细胞中有效地从基因与蛋白两个水平促进成骨-成血管相关关键调节因子的表达与分泌。

除了影响成骨、成血管关键生长因子，在miRNAs对USSC成骨分化的功能性影响研究中，还阐述了内源性CDK6和HDAC4的水平在USSC成骨分化过程中下调，减少了随后mir-26a的异位表达。通过Alizarin-Red染色和钙离子释放试验表明，过表达mir-26a能显著加快USSC的成骨分化，推测可能由成骨抑制蛋白，如周期蛋白依赖性激酶（Cyclindependent kinases，CDK6）和组蛋白去乙酰化酶 4（Histone deacetylase 4，HDAC4）介导。证实成骨抑制因子CDK6、重组人 β-连环素蛋白互作蛋白 1（CTNNBIP1）、HDAC4 和 TOB1，还有SMAD1也是miR-26a的靶点[13]。

2 miR-26a在骨缺损修复中的应用

miRNAs有望作为骨缺损修复的新靶点。与传统的细胞因子或生长因子治疗相比，调节单个水平的miRNAs有望同时影响骨修复中的多条途径。miRNAs治疗可以通过直接给予miRNAs的模拟物或抑制物，但通常这些带负电的小分子不能轻易通过同为负电的细胞膜[19]，而裸露的miRNAs在体内很快就会被降解。因此，找到合适的载体及递送系统将miRNAs高效地转运至细胞中，是目前miRNAs治疗面临的最大问题。以miR-26a在骨缺损动物模型中的应用为例，近年来已在miR-26a递送体系方面有所突破，并联合支架材料的应用，在骨缺损修复中展现了良好效果。Wang等[20]的研究发现，ASCs被透明质酸（HA）支架吸收后，可作为新型组织工程骨替代品嵌入胫骨极限缺损的大鼠。随着miR-26a的转入，成骨相关基因表达极大上调，ALP的产生、胶原的分泌和细胞外基质矿化都有所增加。HE染色观察到新骨形成，而细胞的形态学表现和增殖并未受到明显影响。组织学评估观察到，附着于多孔HA支架的修饰细胞明显促进了新骨在缺损区域的形成。李岩等[8]基于聚醚、聚酯材料，利用聚合和点击化学方法，合成出生物可降解的效率高、毒性小的阳离子miRNA转染体系（线性LPs和超支化HPs），可以在miRNAs穿过细胞膜时不被降解，进入细胞后囊泡膨胀和破解，miRNAs进入细胞质。随后，通过将上述miRNAs转染体系包裹于聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）缓释微球中，再将微球附着于左旋聚乳酸（PLLA）纳米多孔支架上，构建了miRNAs局部缓释体系。在5 cm胫骨极限缺损模型中，原位植入缓释体系的实验组活体micro-CT显示骨缺损完全修复 （对照组仅有少量或中等量的骨修复）。该结果经过micro-CT对新生骨量的半定量检测进一步得到确认。HE染色观察到实验组中新生骨量及新生血管的密度与数量都远高于两个对照组。综合实验结果表明，该miRNAs缓释体系能够在体内环境中实现对Agomir-26a的有效缓释，并同时保持其良好的生物学活性，进而有效转染至缺损区周围细胞，促进缺损区周围机体自身细胞中的成骨-成血管相关关键调节因子的表达与分泌，最终以内源性的调节手段实现最理想的骨缺损修复效果。而在Zhang等[9]的无细胞3D支架和两阶段递送研究中，短的PEG链和一个低分子量的正电PEI结合在一个疏水分子核心的外壳上，miRNAs引起进一步的自我募集，形成一个纳米级球形外壳，被内外两层亲水PEG层夹成三明治结构。这些稳定携带miR-26a的多聚体被包裹在可生物降解的多聚体微粒（MS）中，克服了现有miRNAs转运体系的不受控释放引起的问题。这种两段式miRNAs转运策略使得在受控持续释放的基础上保有高转染率。此外，为防止miRNAs转运过程中的靶向外效应，通过把MS移到一个纳米纤维无细胞3D支架上，可以从时空上控制内源细胞的活化，从而再生修复骨质疏松的老鼠的颅骨缺损。

3 展望

递送系统和细胞来源的缺乏是目前miR-26a应用于骨缺损治疗的主要瓶颈。移植过程中，设计的骨架不仅受制于骨细胞，还要应对炎症和成血管细胞渗透。支架降解引起的不良反应在用较大剂量进行缺损骨骼修复时可能会被放大，而修复大面积骨缺损可能会用到超生理剂量的miR-26a，从而可引发不可预知的结果。因此，炎症和成血管细胞是如何受到miR-26a调控，以及又是如何作用于成骨过程等问题，仍需进一步研究[21]。BMSCs虽然能分化成多个细胞系却难以大量获得，尽管体外扩增可以增加细胞数量，但长期增殖和持续传代，对BMSCs的正常功能存在有害效应[20]。相比之下，源自脂肪组织的ADSCs易大量获取，被认为是干细胞的更可靠来源。然而，尽管能被HA支架或其他支架吸收，ADSCs的成骨分化能力整体受限。研究表明，miRNAs是强大的内源性治疗分子，可以同时调控多种靶基因，在体内的应用可以更好模拟自然调节通路，正如其在细胞中本身的功能，具有改善ADSCs功能的潜力[20]。但是，目前的研究发现，miR-26a在BMSCs和ADSCs两种细胞中的功能有着重叠和矛盾，提示在MSC细胞分化中有着不同的转录后调解路径[8]。因此，很多在BMSCs、USSC中的关于miR-26a促进成骨机制的研究，需要进一步在ADSCs中进行验证和深入研究。此外，miR-26a在ADSCs成骨分化中扮演的角色以及ADSCs成骨分化的具体分子机制还有待进一步阐明，相关通路的明确可以为骨组织再生修复提供新靶点和新方法。

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The Molecular Mechanism and Application of miR-26a in Bone Regeneration

YANG Yating,YU Ziyou,ZHANG Wenjie．Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

【Summary】The ideal means to repair large-sized bone defects is to induce bone regeneration.MicroRNAs(miRNAs),as a modulator at a post-transcriptional level,can regulate the expression of a series of target genes.A number of studies have shown that miR-26a could promote the expression of multiple key growth factors related to osteogenesis and angiogenesis,and further improve the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone formation.Clarifying the molecular mechanism of miR-26a in promoting osteogenic differentiation of stem cells could provide potential targets for bone regeneration.The mechanism and current progresses of miR-26a in promoting osteogenic differentiation and bone regeneration were reviewed.

miR-26a;mesenchymal stem cell; osteogenic differentiation

Q813.1+2

B

1673－0364（2017）06－0346－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.013

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室。

张文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。

2017年8月23日；

2017年10月10日）