益母草碱对慢性心力衰竭心肌重构大鼠心房利钠肽、血管紧张素Ⅱ影响的研究

梁赵文 罗建华 杨冬花 杨辉 卢丽娜 袁露 李利

(1.贵阳中医学院2014级研究生；2.贵州省人民医院内分泌科；3.贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002)



·论 著·

益母草碱对慢性心力衰竭心肌重构大鼠心房利钠肽、血管紧张素Ⅱ影响的研究

梁赵文1罗建华2杨冬花△3杨辉3卢丽娜3袁露3李利3

(1.贵阳中医学院2014级研究生；2.贵州省人民医院内分泌科；3.贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002)

目的 探讨益母草碱对慢性心力衰竭心肌重构大鼠血清心房利钠肽(atrial natruretic peptide，ANP)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ ，Ang Ⅱ)的影响。方法 10只正常SD大鼠作对照组，腹腔注射生理盐水；另80只SD大鼠作为实验鼠，连续2周腹腔注射异丙肾上腺素诱导慢性心力衰竭动物模型。造模成功后实验鼠随机分为5组：模型组(生理盐水)、益母草碱低剂量组(给益母草碱量为7.5 mg/kg/d)、中剂量组(给益母草碱量为15 mg/kg/d)、高剂量组(给益母草碱量为30 mg/kg/d)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，P38MAPK)抑制剂组(给P38MAPK量为0.3 mg/kg/d)，连续予相应药物腹腔注射2周后行心脏超声检测心脏结构及功能，ELIAS法检测血清ANP、Ang Ⅱ含量。结果 (1)与正常组比较，模型大鼠左室后壁厚度(LVPW)、室间隔厚度(IVS)、左室舒张末期内经(LVDd)、左室收缩末期內径(LVDs)以及血清ANP、Ang Ⅱ含量明显增加，而左室射血分数(EF%)、左室短轴缩短率(FS%)则明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)与模型组比较，益母草碱高剂量组和P38MAPK抑制剂组LVPW、IVS、LVDd、LVDs及血清ANP、Ang Ⅱ含量明显降低，EF%、FS%则明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 高剂量益母草碱(30 mg/kg/d)通过减少慢性心力衰竭大鼠血清ANP、Ang Ⅱ含量对抑制心肌重构有一定作用。

益母草碱； 心肌重构； 心房利钠肽； 血管紧张素Ⅱ

研究[1-2]发现益气温阳活血方从多途径、多靶点抑制心肌重构，改善心脏功能，益母草碱为益母草的主要有效成分之一，研究发现其具有抑制心肌纤维化[3]、改善认知功能、促进神经元修复[4]、抗炎[5]、防治糖尿病[6]等多种功能，但在抑制心肌重构、改善心脏功能方面的作用机制有待进一步明确。本研究通过观察益母草碱对慢性心力衰竭心肌重构大鼠血清ANP、Ang Ⅱ含量的影响，初步探讨其抑制心肌重构作用机制，为益母草碱作为防治慢性心力衰竭心肌重构新药物的进一步开发利用提供理论依据和实验数据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为SD雄性大鼠90只，体质量(200±10) g(由重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供，合格证号：2012-0011)。试剂与仪器为异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司)，益母草碱(上海恩域化工科技有限公司)，P38MAPK抑制剂(SB203580，上海碧云天生物技术有限公司)，ANP(Sigma公司)，Ang Ⅱ(Sigma公司)，酶标仪(北京新风公司ZS-3型)，心脏超声仪(Philips公司iU22型)。

1.2 方法 (1)动物分组及治疗:90只健康SD雄性大鼠，同批在动物房适应性饲养7 d后随机分为正常组10只和实验组80只。实验组复制慢性心力衰竭动物模型参照刘艳丽等[7]方法：异丙肾上腺素(5 mg/kg/d)连续2周腹腔注射诱导心肌重构模型。2周后实验组存活大鼠55只，再以心脏超声评价心衰模型成功与否。将造模成功48只大鼠随机分5组并分别给药，模型组(给予生理盐水，10只)、益母草碱低剂量组(给予益母草碱7.5 mg/kg/d，10只)、益母草碱中剂量组(给予益母草碱15 mg/kg/d，10只)、益母草碱高剂量组(给予益母草碱30 mg/kg/d，9只)、P38MAPK抑制剂组(给予P38MAPK抑制剂0.3 mg/kg/d，9只)，正常对照组和模型组给予相同体积生理盐水腹腔注射，每日1次，共2周。所有大鼠均予标准饲料饲养，自由饮水。(2)超声心动图检查：实验结束后，予5%水合氯醛腹腔注射麻醉，卧位固定，左胸前区剃毛，以Philips iU22超声仪、频率为12 MHz探头对大鼠行心脏超声检查，分别测量LVDd、LVDs、LVPW、IVS，测算FS%、EF%。各指标均在连续3个心动周期测量后取其平均值。(3)血清ANP、Ang Ⅱ的检测：6组动物相应时间处死后，采集颈动脉血分离血清，以ELISA法检测ANP、Ang Ⅱ的含量，操作过程参照试剂盒说明进行。

2 结 果

2.1 各组心脏结构及功能的测定 与正常组比较，其他各组大鼠心脏IVS及LVPW增厚，LVDd、LVDs增大，而FS%、EF%值则明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，益母草碱高剂量组和P38MAPK抑制剂组LVPW、IVS、LVDd、LVDs及血清ANP、Ang Ⅱ含量明显降低，EF%、FS%则明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；P38MAPK抑制剂和益母草碱高剂量组上述指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，益母草碱低剂量组和益母草碱中剂量组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1及图1～6。

组别nIVS/mmLVPW/mmLVDd/mmLVDs/mmFS/%EF/%正常组101.53±0.171.66±0.125.79±0.242.84±0.3050.96±4.3981.34±4.28模型组102.05±0.19*2.10±0.16*6.87±0.37*4.75±0.30*30.87±2.41*57.13±3.46*低剂量组102.02±0.20*2.11±0.18*6.90±0.40*4.69±0.61*32.28±5.36*58.87±7.79*中剂量组101.98±0.17*2.02±0.20*7.04±0.45*4.67±0.51*35.17±4.82*60.89±6.88*高剂量组91.81±0.22*△1.88±0.19*△6.42±0.43*△3.83±0.59*△40.61±6.10*△69.86±6.93*△P38组91.78±0.20*△1.85±0.20*△6.35±0.32*△3.75±0.64*△41.12±8.55*△70.09±8.96*△

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

图1 正常组 图2 模型组 图3 益母草碱低剂量组

图4 益母草碱中剂量组 图5 益母草碱高剂量组 图6 P38MAPK抑制剂组

2.2 各组血清ANP、Ang Ⅱ含量的检测 与正常组比较，其他各组大鼠血清ANP、Ang Ⅱ含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，P38MAPK抑制剂组和益母草碱高剂量组上述指标明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；上述指标P38MAPK抑制剂组和益母草碱高剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，益母草碱低剂量组和益母草碱中剂量组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别nANP/(ng/L)AngⅡ/(ng/L) 正常组1066.38±9.9653.58±9.49 模型组10152.52±20.48*137.23±16.54* 低剂量组10145.73±16.86*132.66±14.50* 中剂量组10143.41±16.09*135.32±18.32* 高剂量组984.85±10.90*△92.16±10.32*△ P38组983.67±11.31*△87.69±12.35*△

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨 论

心肌重构是慢性心力衰竭心腔扩大、心室肥厚的过程中，与心肌细胞外基质胶原纤维网等各种组织结构改变相关的结构重构以及与各种信号通道改变相关的重构[8]，是导致心力衰竭不断进展的病理生理学基础。因此，抑制心肌重构已成为慢性心力衰竭的防治关键。目前西药治疗心力衰竭、抑制心肌重构疗效明确，但也存在不容忽视的不良反应及使用禁忌[9]。近年来研究[10]发现，中医药在延缓心力衰竭、改善患者临床症状、对抗心力衰竭西药的不良反应上显示了独特疗效，并具有一定的优势，同时中药协同西药，既可消除或减少血管紧张素转化酶抑制剂和β受体阻滞剂的不良反应，又缩短了药物剂量递增的时间。

益母草为唇形科益母草属植物的新鲜或干燥地上部分，其味辛、苦、微寒，归心﹑肝﹑膀胱经，具有活血祛瘀、利尿消肿之功效，过去主要用于妇女血脉阻滞之月经不调、经行不畅、产后瘀阻疼痛、恶露不尽等，素有“血脉圣药”、“经产良方”之称[11]。研究发现益母草中主要含有的化合物有：生物碱类、黄酮类、二萜类、苷类等,并含有锌、铜、锰、铁等多种微量元素，其中生物碱为益母草属植物的主要有效成分[12]。

本研究结果显示，以异丙肾上腺素造模3～5 d后，模型组大鼠活动减少、蜷缩、进食减少、皮毛松软、体质量减轻，此后症状呈逐渐加重趋势，出现唇周青紫，呼吸减弱，毛色枯槁、散乱竖起、脱毛，口唇及双耳发绀以及死亡等。并且心脏超声显示LVPW、IVS明显增厚，LVDd、LVDs扩大，EF%和FS%下降，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

ANP是由28个氨基酸组成的肽类激素，当出现心力衰竭时，由于心脏前后负荷均明显升高，刺激了ANP的释放[13]。在心衰发展过程中，ANP随着疾病的严重程度，呈动态上升趋势，ANP血清浓度测定能作为判断充血性心力衰竭的指标[14]，ANP的分泌会受到心肌重构标记物Ang Ⅱ受体的影响[15]。本实验结果显示，模型大鼠造模结束后，血清ANP和Ang Ⅱ含量明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。综上结果，模型大鼠出现了慢性心力衰竭症状表现、心脏结构和功能的变化，同时判断心力衰竭严重程度和心肌重构指标血清ANP和Ang Ⅱ含量明显升高，提示造模成功。益母草碱低剂量组和中剂量组予相应剂量干预治疗后上述指标差异无统计学意义(P>0.05)，但益母草碱高剂量组疗效虽未达到正常组水平，但与模型组比较，IVS、LVPW、LVDd、LVDs、血清ANP及Ang Ⅱ含量降低，FS%、EF%值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示当益母草碱治疗剂量达30 mg/kg/d时，能够降低血清ANP和Ang Ⅱ含量，抑制慢性心力衰竭大鼠心肌重构。

P38MAPK是丝裂原蛋白活化激酶其中一条重要信号通路途经，可被多种细胞外刺激信号激活，调节心肌细胞凋亡、肥大细胞炎性反应、成纤维细胞活化和细胞外基质代谢失衡，导致心脏结构和功能受损，最终发展成心力衰竭[8]。当心肌细胞受到如机械牵张、压力负荷、缺血缺氧、NO缺乏等刺激后，以自分泌或旁分泌形式分泌Ang Ⅱ、内皮素-1等因子，这些因子都能通过活化P38MAPK通路，诱导心肌蛋白合成，使心肌细胞增大，促进心肌肥厚的发生[16]。

为明确益母草碱抑制心肌重构的作用机制，本实验同时设立了P38MAPK抑制剂组，发现予P38MAPK抑制剂干预后，IVS、LVPW、LVDd、LVDs、血清ANP及Ang Ⅱ含量明显降低，FS%、EF%值则明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，上述指标益母草碱高剂量组和P38MAPK抑制剂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。益母草碱抑制心肌重构，是否与抑制P38MAPK信号通路活化降低血清ANP和Ang Ⅱ含量有关，具体机制有待于进一步研究。

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Effects of Leonurine on serum atrial natruretic peptide and angiotensin II in the myocardial remodeling of rat with chronic heart failure

LiangZhaowen1,LuoJianhua2,YangDonghua△3,YangHui3,ZhuJingwen3,YuanLu3,LiLI3.

1.GuiyangTraditionalChineseMedicine(TCM)College.Guiyang550002,Guizhou,China. 2.DepartmentofEndocrinology,thePeople'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,Guizhou,China. 3.DepartmentofMedicineforCadre,thePeople'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,Guizhou,China.

ObjectiveTo investigate the effects of Leonurine on serum BNP and Ang II in the myocardial remodeling of rat with chronic heart failure.Methods 10 normal SD rats as control group, meanwhile 80 experimental rats were given isoproterenol of intraperitoneal injection daily for 2w , then the rats with chronic heart failure were divided randomly into five groups, which were the model group, low-dose Leonurine group (7.5 mg/kg/d), middle-dose Leonurine group (15mg/kg/d), high-dose Leonurine group (30 mg/kg/d) , and P38MAPK inhibitor group. During the experiment, different drugs and dose were intraperitoneal injections to different groups and the normal saline was used for normal group and model group. After 2w, cardiac structure and function was tested by echocardiography, content of serum ANP and Ang II were detected by ELISA respectively.Results Compared with those in normal group, LVPW, IVS, LVDd, LVDs, the levels of serum ANP and Ang II in model group were progressively increased, but EF% and FS% were significantly decreased (allP<0.05). Compared with those in model group, LVPW, IVS, LVDd, LVDs, the levels of serum ANP and Ang II in high-dose Leonurine group and P38MAPK inhibitor group were progressively decreased, but EF% and FS% were significantly increased (allP<0.05).Conclusion High-dose Leonurine group (30 mg/kg/d) can inhibit myocardial remodeling in the rat with chronic heart failure maybe through attenuating serum BNP and Ang II.

Leonurine； Myocardial remodeling； Atrial natruretic peptide； Angiotensin Ⅱ

国家自然科学基金项目(81560735)；贵州省社会公关项目(黔科合SY字[2011]3055)；贵州省科技联合基金(黔科合SY[2010]3121号)；贵阳市科技计划项目([2010]筑科农合同字第1-社-37号)

R332;R541.6

B

1000-744X(2016)12-1235-04

2016-10-24)

△通信作者，E-mail：niuniucs0204@126.com