牛病毒性腹泻/黏膜病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

常敬伟，邢思毅，常春龙，毕莹，王士霞，李田田，周玉龙，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛病毒性腹泻/黏膜病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

常敬伟，邢思毅，常春龙，毕莹，王士霞，李田田，周玉龙，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为建立一种检测牛病毒性腹泻、黏膜病病毒抗体的间接ELISA方法，利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白并纯化，使用纯化后的蛋白作为包被抗原。确定最佳抗原包被浓度为6 μg·mL-1，最佳血清稀释度为1∶80，最佳包被液为碳酸缓冲液，最佳盐封闭液为5%脱脂乳，最佳血清作用时间为60 min，酶标抗体作用最佳浓度为1∶10 000；最佳底物作用时间为5 min，阳性临界值为D450nm≥0.282。与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较，总符合率为91.5%，板内和板间重复性试验变异系数均小于10%。该方法与牛副流感病毒Ⅲ型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛冠状病毒阳性血清无交叉反应。因此，该ELISA诊断方法可用于大批量样本抗体水平监测和流行病学调查。

牛病毒性腹泻病毒；E2蛋白；间接ELISA

牛病毒性腹泻/黏膜病（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻黏膜病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引得的接触性传染病，以腹泻、整个消化道黏膜坏死、糜烂或溃疡为特征[1]。6月龄以后的育成牛常发。BVDV主要通过呼吸道和消化道感染动物，既能水平传播也能垂直传播，公牛精液也有病存在，感染病毒的怀孕母牛通过胎盘感染胎儿，分娩产出带毒犊牛。大多数牛呈持续性感染（PI），能引起免疫抑制并能诱发细菌感染[2]，给养牛业造成了重大的经济损失。

近年来，BVDV传播迅速，成为危害中国养牛业的主要疫病。BVDV的高突变率及复杂的临床症状，给诊断和预防带来了困难[3]。BVDV致病机理复杂，目前国内暂无有效疫苗和药物。而当前最有效的方式是检测并剔除发病和隐性感染牛[4]。因此，建立一种快速、有效且适合基层的检测方法是当前中国防制BVDV的首要措施。

E2位于BVDV病毒粒子囊膜表面，能诱导感染动物产生病毒中和抗体并刺激机体发生免疫应答。因此，可作为BVD诊断蛋白。利用E2蛋白建立抗体间接血清学诊断方法，可特异、敏感地检测BVDV发病牛和隐性感染牛。该方法可用于大范围抗体检测，确定抗体水平和BVDV阳性感染牛。原核表达蛋白表达量虽大，但蛋白纯化特别困难。最后选择真核表达系统，运用PEG沉淀法可获得高浓度蛋白。利用表达的蛋白为包被抗原，建立间接ELISA方法可用于BVDV野毒感染的检测，为净化BVDV提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 抗原及血清

BVDV重组E2蛋白为抗原由黑龙江八一农垦大学预防兽医实验室表达纯化并保存，抗原浓度为360 μg·mL-1。牛副流感病毒Ⅲ型（BPIV-3）、牛传染性鼻气管炎（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）和牛冠状病毒（BCV）阳性血清由黑龙江八一农垦大学预防兽医实验室保存。BVDV阳性和阴性血清来购自中国兽药监察所。

1.2 主要试剂

牛病毒性腹泻病毒抗体诊断试剂盒购自美国IDEXX公司（D341）；辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白和明胶均购自Sigma公司；四甲基联苯胺购自Promega公司；脱脂奶粉购自美国BD公司。

1.3 确定抗原包被浓度和阴、阳血清稀释度

使用碳酸盐缓冲液，将纯化的重组BVDV-E2蛋白作0.75、1.5、3、6和12 μg·mL-15个稀释，每个梯度做2个重复。将阳性、阴性血清分别作1∶40、1∶80、1∶160和1∶320稀释，并设对照。封闭液选择5%脱脂奶粉，酶标二抗作1∶5 000稀释，按照常规ELISA方法进行方阵滴定试验，最后用酶标仪测定D450nm值。结果分析，最佳血清浓度为P/N值最大且D450nm≥1、阴性血清DD450nm＜0.2的组合[6]。

1.4 选择最佳包被液

按照1.3所确定最佳抗原包被浓度、血清稀释度，选择碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-盐酸缓冲液按照上述ELISA步骤和判断方法进行试验，选择最佳包被液。

1.5 选择最佳包被时间

按照上述选择的最佳包被液，选择37℃湿盒温育2 h、4℃湿盒过夜和室温过夜进行试验。判定方法同上，确定最佳包被时间。

1.6 确定最佳封闭液

按照已优化的条件，分别选择0.5%明胶、5%脱脂乳、1%酪蛋白和1%BSA作为封闭液，用阴、阳血清按照上述ELISA步骤和判断方法进行试验，选择最佳封闭液。

1.7 选择封闭时间

选择已确定的条件，分别封闭30、60、90和120min，用阴、阳血清按照上述ELISA步骤和判断方法进行试验，选择最佳封闭时间。

1.8 确定血清最适作用时间

将阴性和阳性血清分别孵育30、60、90和120 min，测定D450nm值，确定血清最适作用时间。

1.9 确定最佳酶标二抗工作浓度

将兔抗牛IgG辣根过氧化物酶分别作1∶5 000、1∶8 000、1∶10 000和1∶20 000稀释，其他条件选择已经优化好的条件，判定方法同上，确定最佳二抗工作浓度。

1.10 最佳底物作用时间的优化

按照已优化的反应条件，将TMB底物避光分别作用为3、5、10和15 min终止反应，判定方法同上，确定最佳底物作用时间。

1.11 确定临界值

将46份阴性血清用已建立间接ELISA方法检测，计算D450nm值，确定阴阳性临界值。

1.12 特异性试验

将BVDV阴阳性血清、BPIV-3阳性血清、IBRV阳性血清、BRSV阳性血清和BCV阳性血清进行同时检测，根据D450值进行判断有无交叉反应，评价试验建立的方法的特异性。

1.13 敏感性试验

按照已建立的方法，将BVDV阳性标准血清作8个梯度稀释，稀释倍数为50倍到6 400倍，进行分析结果。

1.14 重复性试验

批内重复性试验：用同一批纯化的蛋白包被的酶标板，检测5份抗体水平不同阳性的BVDV阳性血清样品和1份BVDV阴性血清，进行试验，计算变异系数，分析试验结果。

批间重复性试验：取3块隔周包被在不同酶标板中，用其检测5份已知的不同抗体水平的阳性血清和1份阴性血清，每份血清做3个重复，进行试验。测定结果并分析。

1.15 与商品化试剂盒的比较试验

应用试验建立的间接ELISA方法与美国IDEXX公司BVDV抗体检测试剂盒比较，同时检测来自黑龙江省不同地区的177份牛血清样品，比较诊断准确性并计算符合率。

2 结果与分析

2.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定

由表1可知，抗原浓度为6 μg·mL-1，血清稀释倍数1∶80时，P/N值最高，阳性血清D450nm≥1.0且阴性血清D450nm≤0.2。所以，最佳组合抗原浓度为6 μg·mL-1、血清稀释倍数为1∶80。

表1 最佳血清稀释度和最佳抗原浓度选择Table 1 Determination for optimal concentration of antigen and dilution of sera

2.2 最佳包被液的选择

选用CBS作为包被缓冲液时，37℃湿盒温育2 h时，封闭效果最好。

2.3 最佳封闭液和封闭时间的确定

选最佳组合为5%脱脂乳封闭90 min时，P/N值最高，阳性血清D450nm≥1.0且阴性血清D450nm≤0.2。

2.4 血清最适作用时间的确定

血清作用时间为60 min时，P/N值最大且阳性血清D450nm≥1.0，阴性血清D450nm＜0.2。

2.5 最佳酶标二抗工作浓度的确定

如表2可知，酶标二抗选择1：10 000浓度时，P/N值最大且阳性血清D450nm≥1.0，阴性血清D450nm＜0.2。

表2 最佳酶标二抗工作浓度的确定Table 2 Determination for optimum Rabbit anti-bovine IgG/HRP concentration

2.6 底物工作时间的确定

由表3可知，底物作用时间为5 min时，P/N值最大且阳性血清D450nm≥1.0、阴性血清D450nm＜0.2，因此底物最适作用时间为5 min。

表3 底物最佳工作时间的确定Table 3 Determination for optimum substrate reaction time

2.7 间接ELISA阴阳性临界值的确定

根据46份阴性的血清，计算出阴性血清D450nm的平均值（X）为0.139和标准差（S）为0.047。根据统计学原理，在当OD450nm≥X+3S，即为0.282，当D450nm＜0.282时，可以判定为BVDV阴性。

2.8 特异性试验

用建立的间接ELISA方法对BPIV-3、IBRV、BRSV和BCV阳性血清进行检测。结果可知，4种病毒阳性血清均小于0.282，都在阴性判定范围内，说明无交叉反应。

2.9 敏感性试验

将BVDV阳性标准血清做连续倍比稀释后，用建立的ELISA方法进行检测。结果可知，阳性血清在1：1 600稀释后，D450nm值大于0.282仍为阳性，说明建立的此ELISA方法具有较高的敏感性。

2.10 重复性试验

由表4和表5可知，板内重复性试验变异系数为1.94%～6.11%，批间重复性试验变异系数为4.3%～ 8.13%，均小于10%，表明该ELISA方法重复性较好。

表4 批内重复性检验Table 4 The intro-batch repeatability test

表5 批间重复性检验Table 5 The inter-batch repeatability test

2.11 与商品化试剂盒的对比试验

用试验所建立的间接ELISA方法和美国IDEXX公司的BVDV检测试剂盒同时检测177份临床牛血清样本。由表6可知，两者的阳性符合率为94.8%，阴性符合率为88.3%，总符合率为91.5%。

表6 血清样品的间接ELISA与IDEXX试剂盒检测方法比较Table 6 The comparison of serum detection by indirect ELISA and IDEXX

3 讨论

E2蛋白位于BVDV病毒粒子表面，当牛感染病毒时，是最早产生抗体的囊膜糖蛋白，因此可用于快速诊断[7]。利用昆虫细胞真核表达系统获得蛋白，并和天然蛋白构象较为接近，而且最大程度保留蛋白抗原表位。为建立特异性强、准确性高的BVDV间接ELISA方法奠定了基础。

试验中，当BVDV阳性血清在1∶1 600稀释后，D450nm值大于0.282仍为阳性，说明建立的此ELISA方法具有较高的敏感性。在选用某公司商品化胎牛作为阴性对照血清时，发现其阳性值偏高。经过分析，确定无其他非特异性反应的前提下，发现胎牛血清存在BVDV污染。因此，使用胎牛血清、猪瘟疫苗等生物制品时，应进行实验室检测，确定无污染后才可使用[8]。兽医临床上牛呼吸道疾病综合征多为IBRV、BRSV、BPIV3、BVDV和BCV等病毒和某些细菌的混合感染和继发感染，临床诊断很难进行鉴别[9]。本ELISA方法与以上5种病毒均无交叉反应，具有较好特异性，且重复试验结果变异率在标准之内。

BVDV国际标准检测试剂盒基本上被国外公司垄断，价格昂贵，购买周期太长，不适用于中小型养殖场和散养户。因此，有必要建立一种良好的ELISA方法为国产ELISA试剂盒做技术储备。研究选用商品化美国IDEXX牛病毒性腹泻检测试剂盒，与国外商品化试剂盒相比，本方法阳性符合率为94.8%，阴性符合率为88.3%，总符合率为91.5%。产生这种差异的可能有3个原因，其一可能是试验采用的抗原是纯化后的单一BVDV-E2蛋白，而IDEXX公司的试剂盒为全病毒包被抗原。相比之下，试验的针对性较低。其二可能是E2蛋白在各毒株的变异性较大，试验为一种毒株表达并纯化的E2蛋白作为抗原，具有一定的局限性。其三IDEXX试剂盒所采用的判断标准适合欧美国家牛群的情况，这可能使得符合率出现率偏差。因此，试验建立的间接ELISA方法还有提升的空间，希望在不断的实践和摸索过程中不断完善。

据报道，北京、天津和陕西等7个省市地区牛血清样本进行BVDV抗体检测，结果总阳性率为69.1%[10]，说明BVDV在我国广泛存在。且大部分BVDV患牛呈持续性感染，且BVDV发病机理及临床特征复杂，直接检测病原易漏检[11]。因此，对BVDV抗体的检测能真正了解BVDV感染情况。试验检测了177份黑龙江各地牛场的牛血清，发现黑龙江各地牛血清样品中均能检测到BVDV抗体，可见黑龙江地区BVDV感染严重。目前，国际上防制BVD的措施为检测感染牛并隔离剔除和疫苗免疫两种方法，然而我国目前还没有安全有效的BVD疫苗。本试验为建立一种操作简单、准确有效的ELISA方法，可大批量检测样品，具有良好的特异性、敏感性和重复性。这为国产商品化试剂盒提供技术储备，可用于BVDV抗体水平监测、感染的诊断和流行病学调查。

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Establishment of the Indirect ELISA Detection Method of Bovine Viral Diarrhea Virus

Chang Jingwei，Xing Siyi，Chang Chunlong，Bi Ying，Wang Shixia，Li Tiantian，Zhou Yulong，Ni Hongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）

To establish a ELISA method to detect the antibody of bovine viral diarrhea virus（BVDV），the envelope protein E2 was successfully expressed by insect cells eukaryotic expression systems and purified，using the recombinant and purified E2 protein as antigen.The optimal working parameters were determined as follows，the antigen concentration was 6 μg·mL-1，the serum dilution was 1∶80，the optimal coating buffer was carbonate buffer solution，the block liquid was 5%skimmed milk，the block time was 60 min at 37℃，the antibody concentration was 1∶10 000，the optimum substrate reaction time was 5 min，The cut-off value was 0.282. Compared with foreign commercial kits，the total coincidence rate was 91.5%.There was no cross-reaction with the positive sera of BPIV-3，IBRV，BRSV or BCV in the method.The ELISA method was suitable to a bulk sample BVDV antibody level monitoring and epidemiological investigation.

bovine virus diarrhea virus；E2；indirect ELISA

S858.23

A

1002-2090（2016）06-0074-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.015

2015-11-15

黑龙江省农垦总局“十二五”重点科技攻关项目（HNK125B-11-10A、HNK125B-11-02）。

常敬伟（1988-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2014级硕士研究生。

倪宏波，男，教授，博士研究生导师，E-mail：nihongbo@sina.com。