黑龙江某规模化场奶牛急性乳房炎病原分离鉴定与药敏实验

刘通，刘宇，2，赵静虎，王华欣，周金玲，岳山，何泊宁，刘珊珊，张世勋，王天，刘增禄，朱战波

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江省兽医科学研究所）

黑龙江某规模化场奶牛急性乳房炎病原分离鉴定与药敏实验

刘通1，刘宇1，2，赵静虎1，王华欣1，周金玲1，岳山1，何泊宁1，刘珊珊1，张世勋1，王天1，刘增禄1，朱战波1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江省兽医科学研究所）

2016年5月，黑龙江省某规模化牛场爆发急性乳房炎，为确诊其病因，无菌采取10份乳样进行细菌的分离鉴定，并对分离菌株进行培养特性检查、生化试验鉴定和药敏试验。经检查10份乳样中大肠杆菌单独感染1例，葡萄球菌单独感染1例，链球菌单独感染1例，葡萄球菌和链球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例。该研究为该牛场奶牛乳房炎的病因分析和防治提供了指导。

奶牛乳房炎；细菌分离鉴定；药敏试验

乳房炎是奶牛最重要的常见疾病之一，可引起产奶量和乳品质下降。目前已经发现有超过135种病原可引起乳房炎，根据有无临床症状可将奶牛乳房炎分为隐性乳房炎和临床型乳房炎两种[1]。奶牛乳房炎的主要病原包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌和支原体等，环境性链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等也可引起乳房炎[2-3]。病原菌损害乳房的泌乳组织，给养牛业带来较大的经济损失[4]。

2016年5月，黑龙江省肇东市某规模化场爆发了奶牛急性乳房炎，10余头奶牛出现乳腺炎症。为了确定本次发病的病因，进行了病牛乳样的细菌分离鉴定和药敏试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基与试剂革兰氏染色液、营养肉汤、营养琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、甘露醇氯化钠培养基，各种细菌培养基生化试验管及药敏片均购于杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.2病料无菌采集10份乳样，每份2 mL，放入4℃冰箱低温保存。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断部分奶牛乳房出现红肿热痛症状，挤奶乳汁出现絮状物，产奶量下降或产奶停止等症状。

1.2.2 细菌分离将采集的10份乳样每个取1 mL离心去上清液取沉淀30 μL涂布在绵羊血液琼脂平板上，倒置于37℃培养箱培养18 h，观察菌落形态和生长情况[5]。取生长的单个菌落进行纯化培养及革兰氏染色镜检。取结果为革兰氏阴性菌分别接种在麦康凯伊红美蓝培养基，取结果为革兰氏染色阳性菌接种甘露醇氯化钠培养基并进行触酶试验及兔血浆凝固酶实验[6]。

1.2.3 细菌生化鉴定经染色镜检符合大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌特征的菌株，用接种环挑取单个菌落纯培养物分别接种于到对应生化管中，37℃培养24～36 h后，观察结果并记录。

1.2.4 药敏试验取营养肉汤增菌培养后的菌液，用移液枪吸取100 μL均匀涂抹到整个营养琼脂培养基上，贴药敏片，37℃倒置培养24～48 h，后判定结果参照美国实验室标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法法规[7]。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

通过革兰氏染色镜检及菌落形态分离出4种细菌，第一种为革兰氏阴性两端钝圆粗短的无芽孢小杆菌，多数单个散在，个别成双排列。由乳样涂血平板培养后，形成光滑、半透明、白色菌落。第二种革兰氏染色均为单个成对或成葡萄串状革兰氏阳性球菌。菌落呈圆形，表面光滑凸起，有透明溶血环呈β溶血。第三种为革兰氏阳色菌呈圆形或卵圆形，链状或成双，菌落呈圆形，表面光滑凸起，呈α溶血。第四种革兰氏染色阳性，呈橄榄球状菌，菌落大而厚，表面光滑、湿润、黏稠，容易挑起，质地均匀，呈乳白色。

2.2 细菌鉴定结果

2.2.1 革兰氏染色镜检结果

革兰氏阴性短杆菌在EMB培养基平板上菌落呈黑色带有金属光泽，在MAC培养基平板上菌落呈红色或粉红色，符合大肠杆菌特异性[8]。将G+球菌涂布在高盐甘露醇琼脂培养基上，致病性葡萄球菌能产生黄色的菌落[9]。血浆凝固酶实验：取兔血浆2 mL加入0.4 mL孵育14 h的肉汤培养物，置37℃温箱培养，每隔2 h观察，至8 h血浆凝固[10]。触酶试验：金黄色葡萄球菌的菌株触酶试验有气泡产生。

图1 大肠杆菌革兰氏染色镜检Fig.1 Gram-stained E.coli stained microscopy

图2 金黄色葡萄球菌革兰氏染色镜检Fig.2 Staphylococcus aureus Gram staining

图3 停乳链球菌革兰氏染色镜检Fig.3 Streptococcus dysgalactiae Gram stain staining

图4 酵母菌革兰氏染色镜检Fig.4 Yeast Gram stain microscopy

图5 大肠杆菌血平板菌落形态Fig.5 E.coli on blood plate

图6 大肠杆菌EMB平板菌落形态Fig.6 E.coli on EMB plate

图7 大肠杆菌MAC平板菌落形态Fig.7 E.coli on MAC plate

图8 金黄色葡萄球菌血平板菌落形态Fig.8 SA on blood plate

图9 高盐甘露醇平板菌落形态Fig.9 SA on MSA plate

图10 停乳链球菌平板菌落形态Fig.10 Streptococcus dysgalactiae on blood plate

图11 兔血浆凝固酶实验Fig.11 Rabbit plasma coagulase experiment

图12 触酶实验Fig.12 Tests for catalase

2.2.2 生化试验结果所分离的菌株其生化反应结果。大肠杆菌生化鉴定结果：枸橼酸盐、尿素、VP阴性，精氨酸双水解酶、乳糖、果糖、棉胶糖、山梨醇、鼠李糖、靛基质、苯丙氨酸、卫矛醇、阿拉伯糖阳性。金黄色葡萄球菌生化鉴定结果：葡萄糖、松二糖、β-半乳糖苷（ONPC）、蕈糖阴性，硝酸盐（还原）、精氨酸双水解酶、尿素、乳糖、果糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖、核糖、DNA、麦芽糖、蔗糖阳性。停乳链球菌生化鉴定结果：马尿酸钠、七叶苷、菊糖、棉实糖、甘露醇、水杨苷、6.5%Nacl生长阴性，乳糖、海藻糖阳性。均符合对应细菌生化反应结果。

2.2.3 药敏试验结果药敏试验结果表明如表1所示。

表1 药敏试验结果（单位：mm）Table 1 Drug sensitivity test results（unit：mm）

分离出的四种细菌，根据其抑菌环大小可以判断大肠杆菌对四环素、环丙沙星、复方新诺明高度敏感，对庆大霉素、强力霉素、氯霉素中度敏感。金葡球菌对氯霉素、阿莫西林、头孢噻吩高度敏感，对庆大霉素、强力霉素、复方新诺明中度敏感。停乳链球菌菌对阿莫西林、克林霉素极度敏感，头孢噻吩、庆大霉素、氯霉素高度敏感。

3 讨论

根据临床症状和乳样变化，细菌的分离培养鉴定，生化试验。综上所述可诊断出该场10份乳样中大肠杆菌单独感染1例，葡萄球菌单独感染1例，链球菌单独感染1例，葡萄球菌和链球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例。这几种细菌导致奶牛发病与饲养时环境卫生有很大关系。可采用全身治疗（静注）配合局部治疗（乳区灌注），应选择敏感性较高药物如阿莫西林、环丙沙星，进行乳头灌注治疗，连续用药5～7 d。

酵母菌多引起奶牛隐性乳房炎，长期使用广谱抗生素是其诱因，当大剂量反复使用抗生素后，对抗生素敏感的细菌被抑制或杀死，乳头附近的菌群平衡状态被破坏，从而使酵母菌乘机大量增殖。酵母菌和葡萄球菌混合感染用咪康唑治疗，全群产奶牛连续做三次以上隐性乳房炎治疗，彻底净化运动场。直至把隐性乳房炎将至15%以下，然后再单独对隐性乳房炎进行治疗，乳房炎高发季节（每年的4～10月份），应做全群预防[11]。

［1］邓海平，蒲万霞，俞诗源，等.奶牛乳房炎主要病原菌及其分离鉴定方法研究进展［J］.中国草食动物，2009，29（2）：52-55.

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［3］孙建萍.奶山羊乳腺炎的防治经验［J］.今日畜牧兽医，2014（3）：57-59.

［4］Jørgensen H J，Mathisen T，Løvseth A，et al.An outbreak of staphylococcal food poisoning caused by enterotoxin H in mashed potato made with raw milk［J］.Fems Microbiology Letters，2005，252（2）：267-272.

［5］王晓，王新，郝丹，等.奶牛乳源大肠杆菌耐药性、毒素基因鉴定及PFGE分型研究［J］.畜牧兽医学报，2014，45（3）：463-470.

［6］冉多良，王爱冬.野生岩羊金黄色葡萄球菌分离与鉴定［C］//.中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集.北京：中国畜牧兽医学会，2007.

［7］Wang S，Zhang P Y，Liu Y，et al.Susceptibility Testing of the Combination of enrofloxacin and kanamycin against Some Pathogenic Bacteria of Dairy Cow Mastitis［J］.China Dairy Cattle，2014（9）：23-25.

［8］李路，刘继超，姜铁民，等.北京地区奶牛养殖场中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析［J］.中国乳品工业，2014，42（12）：7-9.

［9］马保臣，秦卓明，蔡玉梅，等.多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用［J］.畜牧兽医学报，2006，37（11）：1202-1208.

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［11］栾正庆.奶牛酵母菌性乳房炎的快速诊断及中药治疗［J］.中国动物保健，2015（9）：51-52.

Identification of Dairy Cattle Mastitis Pathogens and Drug Sensitive Test in Certain Intensive Dairy Farm in Heilongjiang Province

Liu Tong1，Liu Yu1，2，Zhao Jinghu1，Wang Huaxin1，Zhou Jinling1，Yue Shan1，He Boning1，Liu Shanshan1，Zhang Shixun1，Wang Tian1，Liu Zenglu1，Zhu Zhanbo1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；
2.Veterinary Science Research Institute of Heilongjiang Province）

In May 2016，a mastiffs broke out in a dairy farm in Heilongjiang province，to diagnose its cause，it took 10 cases aseptic samples for bacterial isolation and identification of the culture characteristics of the isolated strains and biochemical tests and drug susceptibility testing.In 10 samples，Escherichia coli infection in 1 case，Staphylococcus infection in 1 case，Streptococcus infection in 1 case，Staphylococcus aureus and Streptococcus mixed infection in 4 cases，Staphylococcus aureus and Yeast mixed infection in 2 cases.This study provided a guide to prevention and treatment of dairy cattle mastitis.

dairy cattle mastitis；bacterial isolation and identification；susceptibility test

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0065-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.013

2015-08-10

黑龙江省科技厅课题（GC13B402）。

刘通（1993-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2015级硕士研究生。

朱战波，教授，博士研究生导师，E-mail：zhanbozhu@163.com。