虾脊兰属植物DNA条形码的确立

任阳阳 张梦婷 张嘉丽,2 樊佳佳 张晓存 王 俊,2 刘 霞,2

(1 武汉理工大学化学化工与生命科学学院，武汉，430070； 2 中国中医科学院中药研究所，北京，100700)



虾脊兰属植物DNA条形码的确立

任阳阳1张梦婷1张嘉丽1,2樊佳佳1张晓存1王 俊1,2刘 霞1,2

(1 武汉理工大学化学化工与生命科学学院，武汉，430070； 2 中国中医科学院中药研究所，北京，100700)

目的：结合ITS2、psbA-trnH和matk序列对兰科虾脊兰属植物进行物种区分鉴定研究，并确立能准确鉴别虾脊兰属植物的序列或者序列组合。方法：采用试剂盒法对已收集的6种虾脊兰属植物进行总DNA的提取，通过扩增及测序，运用codencodeV4.2软件对所得序列进行拼接与剪切，使用MEGA5.0对ITS2、psbA-trnH和matk序列3种序列分别进行比对分析，计算种内及种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离，构建Neighbor-joining(NJ)系统聚类树。结果：实验共得到序列56条(包含GenBank序列17条)，ITS2序列和matK序列其种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离，而该属psbA-trnH序列种内遗传距离范围和种间遗传距离范围有重合。结论：ITS2序列和matK序列可以作为虾脊兰属部分植物的鉴定序列，而psbA-trnH序列不能用于虾脊兰属植物的鉴定。

DNA条形码；ITS2；psbA-trnH；matK；虾脊兰属

虾脊兰属(CalantheR.Br.)为兰科地生草本植物，据《中国植物志》中记载，虾脊兰属植物全属约150种，分布于亚洲热带和亚热带地区、新几内亚岛、澳大利亚、热带非洲以及中美洲等地。虾脊兰属植物有“兰中西施”的美称，可见其具有极高的观赏价值，而该属植物不仅外表绚丽还颇有药用价值，在民间多做药用，据文献记载，虾脊兰属植物具有活血止痛、清热解毒等功效[1]，据报道，虾脊兰的酶水解产物为tryptanthrin，indirudin和isatin，这些水解产物在原植物中也存在，它们均具有抗白血病的作用。从虾脊兰乙醇提取物中可提取到1个具有抗菌活性的二氢菲；同时，在虾脊兰属植物中还发现吲哚苷以及具有生理活性的生物碱，这些生物碱的存在使虾脊兰在传统中药中有抗炎、抗菌、抗毒素等作用[2]。然而虾脊兰属植物分类复杂，因为不同种类植物特征性状不明显，所以给虾脊兰属植物的鉴定带来很大的困难，且兰科植物也是生物多样性保护的旗舰类群之一，虾脊兰属作为兰科植物的一种，在中国物种红色名录第一卷将其全部物种列为珍惜濒危物种[3]。因此，寻找一种快速有效鉴别虾脊兰属植物的方法对于虾脊兰属植物具有长远意义。迄今为止，对于虾脊兰属植物的鉴定研究较少，一般只有传统的鉴别方法，而传统的鉴别对于虾脊兰属资源短缺现状来说是非常不利的。DNA条形码技术为直接利用DNA序列进行物种的鉴定,具有独一无二的可重复性,为药用植物鉴定带来了新的机遇。

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段；DNA条形码技术是2003年由加拿大动物学家Hebert首次提出，即利用基因组中一段公认的标准短序列鉴定物种的分子诊断新技术[4-6]。其在生物分类和鉴定方面发展迅速，它能够不受本身性状和外界因素影响，从基因水平上提供一种鉴别依据。该技术不需要形态分类基础，具有操作简单、重复性高、样品用量少等特点，因此该技术在生物物种鉴定与分类、珍稀濒危和贵重生物资源保护、海关贸易监控、生物多样性保护和中药鉴定等领域得到广泛运用。尤其在中药鉴定中，陈士林课题组通过大量样本实验研究提出ITS2+psbA-trnH为主体的植物类DNA条形码鉴定体系[7-10]，该体系具有良好的准确性与稳定性，但对于少数中药ITS2+psbA-trnH序列还不足以对其进行准确的鉴定，因此需要结合其他片段来进行鉴定。matK序列是编码成熟酶K蛋白的基因，是国际生物条形码联盟(CBOL)推荐的植物DNA条形码核心序列[11-13]。我们利用3种不同的引物ITS2、psbA-trnH、matK对6种虾脊兰属的植物进行DNA提取、扩增、测序通过比较其种间和种内遗传距离从而确立能鉴别虾脊兰属植物的序列或者序列组合，为虾脊兰属植物的鉴别提供准确可靠的生物学方法，保障其用药安全，同时也为保护虾脊兰属濒危药用植物资源提供了新的鉴定技术。

1 材料与方法

1.1 材料 6种虾脊兰属植物：棒距虾脊兰(Calantheclavata)、肾唇虾脊兰(Calanthebrevicornu)、虾脊兰(Calanthediscolor)、剑叶虾脊兰(Calanthedavidii)、钩距虾脊兰(Calanthegraciliflora)、三褶虾脊兰(Calanthetriplicata)分别来自利川、广西、广州等不同地区，共计25份样品，材料信息详表见表1。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA的提取 将实验样品用75%乙醇擦拭表面后，称量每个样品约20 mg，加入钢珠，研磨粉碎。用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2 min后，利用植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序 PCR扩增引物见表2。matK分析序列全部从GenBank上下载，其详细信息见表3。PCR反应体系为25，体系内包含2×Tag PCR Mix 12.5(Tiangen Biotech公司，China)，引物(2.5/L)各1.0(TaKa Ra Biotech公司，China)，模板DNA2，双蒸水8.5。PCR扩增程序：95 ℃ 4 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s)循环35次，72 ℃延伸10 min。将扩增后的样品使用ABI3730XL测序仪(Applied Biosystems Co，USA)进行双向测序。

表1 样品信息表

表2 PCR扩增引物

1.2.3 数据处理 应用CodonCode Aligner V4.2(CodonCode公司，USA)对测序峰图进行校对拼接，除去载体及引物区获得相应序列。利用MEGA5.0对所有序列进行分析对比，并基于K2P模型对虾脊兰属植物进行种内和种间遗传距离分析，用邻接(NJ)法构建系统聚类树。

2 结果与分析

2.1 虾脊兰属植物不同序列种内变异分析

2.1.1 虾脊兰属植物ITS2序列种内变异分析 棒距虾脊兰共6条序列，长度263 bp。钩距虾脊兰共3条序列，长度为258 bp，无变异位点。剑叶虾脊兰共3条序列，长度265 bp，无变异位点。肾唇虾脊兰共6条序列，长度为258 bp，无变异位点。

表3 GenBank所下载序列

2.1.2 虾脊兰属植物psbA-trnH序列种内变异分析

棒距虾脊兰、钩距虾脊兰、剑叶虾脊兰、肾唇虾脊兰、三褶虾脊兰、虾脊兰psbA序列长度、种内变异位点数等信息见表5。棒距虾脊兰共5条序列，长度为746 bp，以LRGZ111-1为主导单倍型，在3位点存在A-C变异。钩距虾脊兰共3条序列，长度为780 bp，以GZ032-1为主导单倍型序列，存在20个种内变异位点。剑叶虾脊兰共3条序列，长度为683 bp，以LC1025-1为主导单倍型序列，存在12个种内变异位点。肾唇虾脊兰共6条序列，长度为858 bp，以LC922-1为主导单倍型序列，存在58个种内变异位点。三褶虾脊兰共4条序列，长度为598 bp，以GX1005-1为主导单倍型序列，在596位存在A-C变异、597位存在C-T变异。虾脊兰有来自GenBank的3条序列(序列号见表3)，长度为757 bp，以KC704336为主导单倍型序列，存在33个种内变异位点。

2.1.3 虾脊兰属植物matK序列种内变异分析 此处所用的matK序列全部从GenBank上下载得到(序列号见表3)，棒距虾脊兰共2条序列，长度为1 662 bp，以KF67379为主导单倍型，存在6个种内变异位点。钩距虾脊兰共3条序列，长度为1 690 bp，以KF673800为主导单倍型序列，在481位点存在A-G变异。剑叶虾脊兰共3条序列，长度为1 692 bp，以KF673796为主导单倍型序列，存在8个种内变异位点。三褶虾脊兰共3条序列，长度为1 690 bp，以KF673822为主导单倍型序列，存在101个种内变异位点。虾脊兰共2条序列，长度为666 bp，无变异位点。

2.2 虾脊兰属植物不同序列种间变异分析 棒距虾脊兰、钩距虾脊兰、剑叶虾脊兰、肾唇虾脊兰、三褶虾脊兰、虾脊兰3种不同序列长度范围、种间变异位点数等信息见表4。

表4 虾脊兰属种间不同序列特征

2.3 虾脊兰属植物不同序列种内、种间遗传距离分析 基于K2P遗传距离，对虾脊兰属3条不同的DNA条形码候选序列的种内变异和种间变异结果进行分析。见表5。虾脊兰属ITS2序列种间变异(0.032～0.166)大于其种内遗传距离(0)，但是钩距虾脊兰和肾唇虾脊兰其种间遗传距离过小，表示此2种植物利用ITS2序列不能分开，但是通过分析其matK种间距离结果发现通过matK序列是可以将其分开。虾脊兰属matK序列种间变异(0.009～0.430)大于其种内遗传距离(0～0.004)，但是虾脊兰和棒距虾脊兰以及虾脊兰和剑叶虾脊兰遗传距离过小表示2种植物利用matK序列不能分开，但是通过分析其ITS2种间距离结果发现，通过ITS2序列是可以将其分开。因此，综上所述，ITS2序列和matK序列可以作为鉴别虾脊兰属植物分子鉴定的序列组合。虾脊兰属psbA-trnH序列种间遗传距离(0.002～0.148)和种内遗传距离(0～0.055)有重叠区，所以psbA-trnH序列不适用于虾脊兰属植物的鉴定。

表5 虾脊兰属不同基因序列种内和种间K2P遗传距离汇总

注：*：平均值

2.4 虾脊兰属植物不同序列的NJ树的建立

2.4.1 本研究基于ITS2序列构建虾脊兰属各个种间的NJ树(图1)结果表明，除了钩距虾脊兰和肾唇虾脊兰被分在一枝，其他各个种都能通过ITS2序列被很好的区分开来。

图1 基于ITS2序列构建虾脊兰属各个种间的NJ树

注：Bootstrap1000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%。

图2 基于matK序列构建虾脊兰属各个种间的NJ树

注：Bootstrap1000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%。

2.4.2本研究基于matK序列构建虾脊兰属各个种间的NJ树(图2)结果表明除了钩距虾脊兰和肾唇虾脊兰外其他物种都能通过matK序列被很好的区分开。但是在前面种间遗传距离的分析中得知，钩距虾脊兰和肾唇虾脊兰种间遗传距离是大于其种内遗传距离的，而在NJ树上其却合为一枝，但是肾唇虾脊兰的matK序列网上只有一条，所以在此并不具有说服力，综上可以得出，将matK序列作为ITS2序列的互补序列用来鉴别虾脊兰属植物，其鉴别效率具有很高参考价值。

2.4.3本研究基于psbA-trnH序列构建虾脊兰属各个种间的NJ树(图3)结果表明，大多数虾脊兰属植物的psbA-trnH NJ树都汇到一起，其分离效率很差，所以psbA-trnH序列不适用于虾脊兰属植物的鉴定。

图3 基于psbA-trnH序列构建虾脊兰属各个种间的NJ树

注：Bootstrap1000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%。

3 结论

近年来，DNA条形码技术在生物分类和鉴定方面发展迅速，它能够不受本身性状和外界因素影响，从基因水平上提供一种鉴别依据。我们在本文是通过对虾脊兰属6个样品3种不同DNA序列进行对比分析，从而确定能鉴定虾脊兰属植物的序列或序列组合，为保证其用药安全以及保护濒危物种提供一种快速简便的鉴定方法。

本研究收集了来自广州、广西、利川等地的6个虾脊兰属样品，选用ITS2序列、psbA-trnH序列和matK序列，对其变异位点进行分析，应用基于K2P计算的遗传距离分别对3种序列的种内和种间距离进行比较分析结果表明，ITS2序列和matK序列其种内遗传距离小于种间遗传距离，可以将其作为基因组序列用于虾脊兰属植物的鉴定，而psbA-trnH序列种内遗传距离范围和种间遗传距离范围有重合，所以psbA-trnH序列不能用作虾脊兰属植物的鉴定。之后利用3种片段分别构建NJ树可以看出，ITS2和matK序列除了钩距虾脊兰和肾唇虾脊兰聚为一枝外，其他各个物种都能很明显的区别开来，表现出很好的单系性，而肾唇虾脊兰的matK序列只有网上一条，在此并不能否定matK序列对虾脊兰属植物的鉴定效率，所以利用ITS2+matK基因组序列能够对虾脊兰属植物进行快速鉴别。而psbA-trnH序列NJ树的表明，虾脊兰属大部分植物不能被区分，其鉴定准确率太低，不适于虾脊兰属植物的鉴定。

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(2016-03-31收稿 责任编辑：洪志强)

Establishment of DNA barcode for the calanthe

Ren Yangyang1,Zhang Mengting1,Zhang Jiali1,2,Fan Jiajia1,Zhang Xiaocun1,Wang Jun1,2,Liu Xia1,2

(1SchoolofChemistry,ChemicalEngineeringandLifeSciences,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan430070,China; 2ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,InstituteofChineseMateriaMedica,Beijing100700,China)

Objective:Combined with the ITS2 and psbA-trnH and matK sequence to identify the medicinal plant-calanthe，and establish genus sequences which can accurately identify the calanthe.Methods:Extracting total DNA from 6 species of calanthe，which had been collected by the kit method，Then the sequences were amplified and sequenced，Using codencodeV4.2 software to of splic and shear the sequences，Comparing of all sequences of 6 species of the genus using MEGA5.0 software,The variable sites,the Kimura 2-Paramter(K2P)genetic distances and the Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed by MEGA5.0.Results:56 sequences(including 17 GenBank sequences)were obtained f.By analysis，ITS2 sequence and matK sequence of the intraspecific genetic distance is less than the inter species genetic distance，the intraspecific genetic distance and inter species genetic distance of psbA-trnH sequence was coincident.Conclusion:ITS2 sequence and matK sequence can be used as the identification sequence of the partial plants of the calanthe,however psbA-trnH sequence could not be used for the identification of the calanthe.

DNA barcode; ITS2；psbA-trnH；matK；Calanthe

国家重大科技专项子课题“中药新药安全性检测技术与标准研究”——中药原料药混伪品分子基因鉴定技术与标准(编号：2014ZX09304-307-001-020)

任阳阳(1992.09—)，女，硕士研究生，研究方向：中药资源鉴定

刘霞(1973.02—)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要研究方向：中药资源与鉴定，E-mail:lrx1125@126.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.058