复方益智颗粒对Aβ25-35致PC12细胞损伤的神经保护作用研究

郝二伟 邓家刚 杜正彩 侯小涛 缪剑华

(1 暨南大学生物医学工程博士后流动站，广州，510632； 2 广西中医药大学广西中药效筛选重点实验室，南宁，530001； 3 广西药用植物园，南宁，530000)



复方益智颗粒对Aβ25-35致PC12细胞损伤的神经保护作用研究

郝二伟1，2，3邓家刚2杜正彩2侯小涛2缪剑华3

(1 暨南大学生物医学工程博士后流动站，广州，510632； 2 广西中医药大学广西中药效筛选重点实验室，南宁，530001； 3 广西药用植物园，南宁，530000)

目的:探讨复方益智颗粒对Aβ25-35导致PC12细胞损伤的保护作用，为进一步研究该产品改善阿尔茨海默症记忆功能障碍的作用机制奠定基础。方法:取经不同处理的PC12细胞分为正常对照组、Aβ25-35模型组、Aβ25-35+正常血清组、Aβ25-35+CYZG含药血清组(不同浓度)。正常对照组：DMEM培养基培养48 h，Aβ25-35模型组：DMEM培养基培养24 h后换含20 μM Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h，Aβ25-35+正常血清组：正常血清预处理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h，Aβ25-35+CYZG含药血清组：不同浓度CYZG含药血清预处理24 h后，加入20 μM Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h。分别采用MTT法检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测PC12神经细胞凋亡情况。结果：Aβ25-35时间依赖性地抑制PC12细胞的生长，不同浓度CYZG含药血清对其造成的细胞损伤有保护作用，随着含药血清剂量的增加，细胞的存活率增加，生长抑制率减少。Aβ25-35能显著引起PC12细胞凋亡，不同浓度CYZG含药血清对其造成的细胞凋亡有抑制作用。结论：复方益智颗粒对Aβ25-35引起的PC12细胞损伤具有一定的保护作用，其神经保护作用可能与抑制Aβ25-35引起的PC12细胞凋亡有关。

阿尔茨海默症；Aβ25-35；细胞凋亡；中药

复方益智颗粒是中泰联合开发的具有改善记忆功能的中药保健产品，处方由人参、绞股蓝、三七等6味中药组成，2012年已获得生产批文和国家发明专利。前期动物和人体试验表明，复方益智颗粒具有显著的改善人体记忆功能的作用[1]；在小鼠跳台、避暗、水迷宫3项试验中均被证明具有确切的改善记忆的作用[2]，可显著改善老龄小鼠的学习记忆能力[3]；复方益智颗粒对Aβ25-35致老年性痴呆模型大鼠空间学习记忆损害也具有明显改善作用[4]。我们采用Aβ25-35诱导建立老年痴呆细胞模型，观察益智颗粒对Aβ25-35致PC12细胞损伤和凋亡的保护作用，以期揭示该产品改善阿尔茨海默病患者记忆功能障碍的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠20只，质量300 g左右，雄性，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。许可证号：SYXK(湘)2014-0012。笼中鼠颗粒饲料饲养，自由饮食，每天给予12 h光照，适应性饲养1周后才能进行实验操作。所有动物喂以标准颗粒饲料均由广西中医药大学实验动物中心提供。

1.2 细胞株 PC12大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，购于上海中科院细胞库。

1.3 试剂及仪器 马血清(Gibco，美国)、青霉素-链霉素溶液(100X)(碧云天)、胎牛血清(Gibco，美国)、胰蛋白酶(碧云天)、DMEM培养基(Gibco，美国)DMSO(Amresco，美国)、Aβ25-35(Sigma，美国)、DMEM高糖培养基(Gibco，美国)、MTT试剂盒(Sigma，美国)、Annexin V-FITC流式凋亡试剂盒(BD，美国)。

倒置显微镜(OLYMPUS，日本)、流式细胞检测仪(BD，美国)、多功能酶标仪(ThermoFisher，美国)。

1.4 PC12细胞体外培养 DMEM培养基(Gibco)，10% FBS，1%抗生素(antibiotics/antimycotics(GibcoBRL)，2～3 d换液1次，细胞80%融合度时传代。可按照1∶4传代比例进行，37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱。

1.5 含药血清的制备 雄性SD大鼠20只，体重300左右g，随机分为正常对照组和CYZG组，每组10只，CYZG组灌胃给予CYZG混悬液(14 mL/kg)，对照组给予相同体积的生理盐水，2次/d，2次之间间隔6 h，连续10 d，末次给药2 h后腹主动脉采血，收集血清，56 ℃水浴灭活补体，经0.22 μm微孔滤膜抽滤除菌，-20 ℃分装保存备用。

1.6 AD细胞模型建立 采用Aβ的活性片段Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡建立AD的细胞模型。PC12细胞用含10%马血清、5%胎牛血清、100U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养，4～5 d传代1次。取对数生长期的细胞传代，传代时用0.25胰酶消化，显微镜下观察待细胞突起开始收缩时加入含血清的培养基中和，移液枪吹散细胞。收集细胞于15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min去上清，新鲜培养基重悬细胞后接种于96孔培养板，细胞接种24 h后吸去旧培养基，加入含Aβ25-35(20 μM)不含血清的培养基，继续培养24 h后用于后续指标检测。

1.7 MTT法检测细胞增殖情况 1)取经不同处理的细胞分为8个组：对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+正常血清组、Aβ25-35+CYZG血清40 μL组、Aβ25-35+CYZG血清60 μL组、Aβ25-35+CYZG血清80 μL组、Aβ25-35+CYZG血清100 μL组、Aβ25-35+CYZG血清120 μL组，计数调整细胞浓度至1×105/mL。2)分别接种于96孔板中，每孔200 μL，每组细胞设3个复孔。3)将96孔板移入培养箱中培养(37 ℃，5% CO2)，培养细胞到适当时间。4)对照组：DMEM培养基培养48 h；Aβ25-35组：DMEM培养基培养24 h后换含20 μM Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h；Aβ25-35+正常血清组：正常血清预处理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h；Aβ25-35+CYZG血清组(40 μL,60 μL,80 μL,100 μL,120 μL)：CYZG含药血清预处理24 h后加入20 μM Aβ25-35的DMEM培养基继续培养24 h。5)向每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。6)将培养板在培养箱内孵育4～6 h。7)终止培养，小心吸去孔内培养液。8)每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。9)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解递质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

1.8 流式细胞仪检测PC12神经细胞凋亡 1)取经不同处理的细胞分为8个组：对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+正常血清组、Aβ25-35+CYZG血清40 μL组、Aβ25-35+CYZG血清80 μL组、Aβ25-35+CYZG血清120 μL组，计数调整细胞浓度至1×105/mL。用6孔板培养细胞，待细胞生长达到60%～70%，吸出旧培养基，根据实验需求处理，继续培养。2)根据实验处理时间，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞1次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。转移到离心管内，1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。3)取5万～10万重悬的细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。4)加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。5)室温(20～25 ℃)避光孵育10 min。可以使用铝箔进行避光。6)1 000 g离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。7)加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

2 实验结果

2.1 复方益智颗粒对PC12细胞增殖的影响 见表1。

表1 不同浓度CYZG含药血清对PC12细胞增殖的影响

注:与Aβ25-35组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图1 不同浓度CYZG含药血清对PC12细胞增殖的影响

注：1：Aβ25-35组；2：Aβ25-35+正常血清组；3：Aβ25-35+CYZG血清40 μL组；4：Aβ25-35+CYZG血清60 μL组；5：Aβ25-35+CYZG血清80 μL组；6：Aβ25-35+CYZG血清100 μL组；7：Aβ25-35+CYZG血清120 μL组；抑制率(%)=1-实验组去除空白后OD值/对照组去除空白后OD值。

根据以上实验结果分析，Aβ25-35时间依赖性地抑制PC12细胞的生长，含药血清对其修复作用有剂量依赖性，随着含药血清剂量的增加，细胞的存活率增加，生长抑制率减少。PC12对后续实验低血清处理组为Aβ25-35+CYZG血清40 μL组；中血清处理组为Aβ25-35+CYZG血清80 μL组；高血清处理组为Aβ25-35+CYZG血清120 μL组。

2.2 复方益智颗粒对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测各组细胞annexinV/PI染色情况显示，Aβ25-35处理PC12细胞能够显著增加细胞凋亡率(与正常对照组比较，P<0.01)，Aβ25-35+正常血清处理组对Aβ25-35引起的细胞凋亡没有明显的影响，不同剂量CYZG含药血清对Aβ25-35引起的细胞凋亡均可以起到明显的抑制作用，Aβ25-35+CYZG40 μL组、Aβ25-35+CYZG血清80 μL组、Aβ25-35+CYZG血清120 μL组的凋亡率明显下降(与Aβ25-35模型组比较，P<0.01)。

图2 CYZG含药血清对Aβ25-35致PC12细胞凋亡的影响

注：1：正常对照组，2：Aβ25-35组，3：Aβ25-35+正常血清组，4：Aβ25-35+CYZG血清组(低)，5：Aβ25-35+CYZG血清组(中)，6：Aβ25-35+CYZG血清组(高)。

图3 各组细胞流式细胞仪检测信号图

注：P2-Q2：晚期凋亡细胞；P2-Q3：早期凋亡。

3 讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)，是一种严重危害老年人身心健康的中枢神经系统退行性疾病，临床表现为进行性记忆力减退、认知功能障碍、分析判断力下降、意识模糊和智力逐渐丧失，最终导致生活不能自理[5]。其特征性病理变化为大脑皮质萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积，神经元纤维缠结(Neuro Fibrillary Tangles，NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(Senile Plaque，SP)的形成[6-8]。目前，对于AD的发病机制有多种假说，其中“Aβ级联反应学说”已为大多学者所接受，即各种原因所致的Aβ(β-amyloid)代谢异常，引起Aβ在脑组织的异常增多，在此过程触发了与AD病理生理、生物化学相关的级联反应，如胆碱能神经损害、突触可塑性功能障碍等，最终导致神经元损害并引起痴呆[9]。因此，Aβ作为一个重要的分子靶点，已经成为治疗阿尔茨海默病药物研究与开发的重点[10]。

本实验采用Aβ25-35处理PC12细胞建立AD细胞模型。结果表明，Aβ25-35预处理PC12细胞24 h后，造成细胞损伤，抑制细胞的增殖；CYZG含药血清预处理24 h后，细胞抑制率降低，不同浓度CYZG含药血清均能显著降低细胞抑制率，且呈剂量依赖性；提示CYZG可以有效的抑制Aβ对神经细胞造成的毒性，从而起到保护神经细胞的作用。

Aβ聚集是AD的早期变化之一，可能导致中枢神经系统细胞死亡[11-12]。神经细胞凋亡是AD患者脑内出现大量神经元丢失现象的重要原因之一[13-15]。本研究结果表明，Aβ25-35处理PC12细胞能够显著增加细胞凋亡率不同剂量CYZG含药血清对Aβ25-35引起的细胞凋亡均可以起到明显的抑制作用。本研究结果揭示复方益智颗粒可对抗Aβ25-35聚集导致的神经细胞损伤和凋亡，具体分子机制还有待进一步研究。

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(2016-10-17收稿 责任编辑：洪志强)

Neuroprotective Effect Research of Compound Yizhi Granule on the PC12 Cell Injury Model Induced by Aβ25-35

Hao Erwei1，2，3, Deng Jiagang2, Du Zhengcai2, Hou Xiaotao2, Miao Jianhua3

(1ThePost-DoctoralResearchStationofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China；2GuangxiMedicinalBotanicGarden,Nanning530000,China; 3GuangxiKeyLaboratoryofEfficacyScreeningofChineseMateriaMedica,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

Objective:To observe the protection effects of Fufang yizhi Granule on the cellular damage induced by the protein Aβ25-35,and to be the basis of further study on the mechanism of this product to improve the memory in Alzheimer′s disease. Methods: Different processing cells were divided into Normal control group, Aβ25-35model control group, Aβ25-35+Normal serum group, and Aβ25-35+CYZG serum group, then given different procedure. Normal control group: cultured with DMEM medium for 48 h, Aβ25-35model control group, 24 h after being cultured with DMEM medium, then added the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h. Aβ25-35+Normal serum group: 24 h after being cultured with DMEM medium contained normal serum, then add the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h, Aβ25-35+CYZG serum group: 24 h after being cultured with DMEM medium contained CYZG serum, then add the medium contained 20 μMAβ25-35and continuously cultured 24 h. Results: Protein Aβ25-35could time-dependently inhibit the growth of PC12 cells, CYZG serum of different concentrations had protective effect on the cellular damage, with the increase of the CYZG serum dosage, the cell survival rate increase, and growth inhibition rate decrease. Protein Aβ25-35could induce the apoptosis of PC12 cells, CYZG serum of different concentrations significantly inhibited the apoptosis. Conclusion: Fufang yizhi Granule could protect the PC12 from the damage induced by Protein Aβ25-35, the mechanism of neuroprotective effect of Fufang yizhi Granule may relate with the inhibition effect of apoptosis.

Alzheimer′s disease; Aβ25-35; Apoptosis; Chinese Materia Medica

广西国际科技合作项目(编号：桂科合1347004-16)；广西重点实验室建设项目(编号：15-140-31)；广西农作物废弃物功能成分研究协同创新中心建设(编号：CICAR2015-Z1)

邓家刚，教授，博士研究生导师，研究方向：中药药效筛选及中药基础理论研究；E-mail：dengjg53@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.006