结核杆菌特异性细胞免疫反应检测（酶联免疫法）临床应用探讨

杨成云++++++涂志永++++++丁超++++++李梦君

[摘要]目的 比较结核杆菌特异性细胞免疫反应检测（A.TB检测）和结核菌特异性抗体检测在结核诊断中的应用价值。方法 选取2014年7月～2015年12月来我院感染科就诊的结核病或疑似结核病患者113例；选取同期我院体检中心的健康志愿者20名作为对照。将其分为结核病组（65例）、非结核病组（48例）、健康志愿者组（20名），所有受试者均进行平行检测，采用A.TB检测和结核菌特异性抗体检测，非结核病组和健康对照组还要进行PPD试验。结果 A.TB检测对结核病辅助诊断的敏感度为86.27%，特异度为75.15%，结核菌特异性抗体检测分别为73.91%和59.46%；两种方法阳性预测值和阴性预测值比较，差异有统计学意义（χ2=3.941，P=0.047；χ2=5.268，P=0.022）。A.TB检测及结核菌特异性抗体检测均与PPD皮试结果呈正相关（r=0.280，0.253，均P<0.05）。结论 A.TB检测的敏感度和特异度均显著优于结核菌特异性抗体检测，综合考虑A.TB检测技术的开展要求，适合在各基层医院推广应用。

[关键词]结核病；γ干扰素释放试验分析技术；A.TB检测

[中图分类号] R52 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0146-03

[Abstract]Objective To compare the application value of specific cellular immune response to tuberculosis bacilli （A.TB detection） and Mycobacterium tuberculosis antibody in diagnosis of tuberculosis.Methods From July 2014 to December 2015，113 tuberculosis （TB） suspects who visited the infectious disease section of our hospital were recruited.During the same term，20 healthy volunteers were included as control.Of the 133 subjects，65 cases were in TB group，48 cases were in non-TB group and 20 cases were in control group.All subjects were tested by both A.TB and TB-Ab，while tuberculin skin test （TST） was performed among subjects in non-TB group and control group.Results The sensitivity and specificity of A.TB were 86.27% and 75.15%， respectively.While the sensitivity and specificity of TB-Ab were 73.91% and 59.46%，respectively.There were significant differences between those of A.TB and TB-Ab （χ2=3.941，P=0.047 and χ2=5.268，P=0.022，respectively）.Both A.TB and TB-Ab had positive correlation with TST results （r=0.280，P<0.05 and r=0.253，P<0.05，respectively）.Conclusion The performance sensitivity and specificity of A.TB are significantly superior to TB-Ab.According to A.TBs′test specification，A.TB is suitable for clinical application in primary hospitals at all levels.

[Key words]Tuberculosis；Interferon gamma release assay；A.TB detection

我国是结核病高发国家之一，每年新增结核病患者约150万。因此结核病是我国重点控制的重大疾病之一，结核病的暴发将会给中国的公共卫生安全带来极大的威胁[1-3]。在结核病防治中，如何快速准确地诊断结核是笔者面临的最大难题之一。

目前常用于临床诊断的方法无法及时、有效地对结核病进行诊断。近年来，γ干扰素释放试验分析技术（IGRA）被用于结核病的诊断，已有研究显示出了良好的应用前景[4-5]。其中有两种比较成熟的γ干扰素释放试验方法，即酶联免疫吸附法（ELISA）和酶联免疫斑点法（ELISPOT）[6]。本研究选用结核杆菌特异性细胞免疫反应检测（A.TB）（酶联免疫法）试剂，通过与传统方法对比，探讨其在临床特别是在基层医院中的应用价值。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2014年7月～2015年12月来我院感染科就诊的结核病或疑似结核病患者113例；同期招募在我院体检中心的健康志愿者20名进行分组观察及对照。

具体分为：①结核病组65例，年龄18～59岁，平均（37.50±10.20）岁；男42例，女23例；伴有空洞15例，为肺结核或肺外结核患者，有典型的结核临床症状，细菌学、病理学和影像学明确诊断，抗结核治疗有效，抗结核治疗时间≤4周。②非结核病组48例，年龄17～63岁，平均（42.22±13.90）岁；男36例，女12例；伴有空洞7例，为疑似结核病经临床或细菌学、病理学和影像学病理检查排除结核病，无结核病史或接触史，PPD试验阴性。③健康志愿者组20例，年龄17～20岁，平均（18.39±1.14）岁；男12例，女8例；在我院体检中心体检，身体健康，无结核病史或接触史，PPD试验阴性。

纳入标准：①符合“结核病”西医诊断标准或排外诊断标准者；②年龄17～65岁者；③依从性良好并自愿签署知情同意书者。

排除标准：①合并心脑血管、肾和造血系统等严重原发性疾病及精神病患者；②对本试验用药过敏者；③有人免疫缺陷病毒感染、急性病毒感染者；④有免疫抑制剂用药史者；⑤妊娠妇女[7]。

诊断标准：依据《中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断标准（WS288-2008）》《中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）》《临床诊疗指南·结核病分册》[8]。

所有受试者均同时进行A.TB和结核菌特异性抗体检测，非结核病组和健康对照组还要进行PPD试验，所有受试者遵守赫尔辛基宣言和临床药理试验管理（GCP）规范，获得南昌县人民医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂

水浴锅、酶标仪、A.TB试剂盒（海口维瑅瑷生物研究院）、结合抗体试剂盒、结核菌素。

1.3方法

采用A.TB试剂盒进行IGRA检测。将肝素钠抗凝的全血4 ml颠倒混匀，分别吸取1 ml全血加入阴性刺激剂（N）、阳性刺激剂（P）、ESAT-6和CFP-10（T） 3个反应管中，将混匀后的N、P、T管在37℃水浴箱中培养22～24 h，取上清血浆50 μl分别加入已加好50 μl稀释液的目标孔中，37℃孵育1 h后洗板，分别加入100 μl检测抗体工作液，37℃孵育30 min后再次洗板，分别加入100 μl亲和素-辣根过氧化物酶，37℃孵育30 min后洗板，然后加入混合好的底物A与底物B 100 μl，37℃避光孵育10 min后加入100 μl终止液。15 min内用酶标仪读取450 nm处的OD值，然后代入标准曲线方程得到N、P和T 3个浓度值，再计算（T-N）/（P-N）值，当N<0.5 IU/ml时，（T-N）/（P-N）≥0.60时判为阳性；当N≥0.5 IU/ml时，（T-N）/（P-N）≥0.85时判为阳性。所有患者均行结核抗体和结核菌素检测。

1.4统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，两种检测方法与PPD试验结果的相关性采用秩和相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 A.TB试验检测结果

对133例样本进行A.TB试验检测，结核病组检出阳性56例，非结核病组检测阳性16例，健康志愿者组检测1例阳性。A.TB检测对结核病辅助诊断的阳性预测值为86.27%，阴性预测值为75.15%。

2.2 A.TB检测与结核抗体结果的比较

A.TB检测对结核病辅助诊断的敏感度为86.27%，特异度为75.15%，结核菌特异性抗体检测分别为73.91%和59.46%；两种方法敏感度和特异度比较，差异有统计学意义（χ2=3.941，P=0.047；χ2=5.268，P=0.022）。A.TB检测及结核菌特异性抗体检测均与PPD皮试结果呈正相关（r=0.280，0.253，均P<0.05）（表1）。

3讨论

结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一[9-10]。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。结核病是我国重点控制的重大疾病之一，结核病的暴发会给中国的公共卫生安全带来极大的威胁[11]。

结核病防治的最大挑战之一是缺乏先进的诊断工具，目前用于临床诊断的方法包括痰培养、痰涂片、结核菌素试验、抗体检测、PCR分子诊断、影像学检查等，这些方法要么敏感度低，要么特异度低，无法有效地对结核杆菌的感染进行诊断[12-14]。因此，临床上结核病的误诊和漏诊非常普遍，基层医院更是如此。结核病的预防和治疗，均迫切需要更敏感和特异的诊断技术[15]。近年来，IGRA被用于结核病的诊断成为热点[16]。IGRA是一种用于结核杆菌感染的体外免疫检测的新方法。现有研究表明，IGRA不受卡介苗接种和非结核分枝杆菌感染的影响，在MTB感染（包括活动性结核病和潜伏感染）中的诊断价值较高[17]。美国CDC指南建议，在当前应用结核菌素试验PPD的所有情况下均可采用IGRA替代，多个大型公共卫生机构已将结核菌素试验PPD全部替换为IGRA。IGRA技术目前已获得欧美国家FDA批准认证。

IGRA技术目前有2种，包括基于全血细胞培养的ELISA和基于外周血淋巴细胞培养的ELISPOT。已有研究表明，两者诊断性能相似，显示出了良好的应用前景。在2011年之前，全球仅有澳大利亚和英国以IGRA技术开发出来的产品。国内多个研究集中在ELISPOT检测技术上，对ELISA检测技术方法的研究报道极少，且IGRA技术在基层医院几乎没有开展。

A.TB试剂盒是海口VTI生物研究院基于IGRA研发出的国内首款体外细胞免疫诊断试剂盒，为ELISA检测技术，于2011年7月正式获国家食品药品监督管理局批准。首都医科大学附属北京胸科医院高孟秋等[3]研究认为，A.TB（ELISA）和T-SPOT.TB（ELISPOT）检测的整体诊断性能相似，A.TB检测在操作和结果判读方面明显优于T-SPOT.TB检测，且对操作者的技能和实验室设备的要求较低。

本研究结果显示，A.TB检测对结核病辅助诊断的敏感度为86.27%、特异度为75.15%，结核抗体检测分别为73.91%和59.46%；两种方法的阳性预测值和阴性预测值比较，差异有统计学意义（χ2=3.941，P=0.047；χ2=5.268，P=0.022）。A.TB检测及结核抗体检测均与PPD皮试结果呈正相关（r=0.280，0.253，均P<0.05），与陈雪林等[17]的研究结果相符。

综上所述，A.TB试剂在结核病临床辅助诊断中的应用价值显著高于结核菌特异性抗体检测，对结核病具有重要的辅助诊断价值，尤其适用于我国卡介苗接种的人群。对菌阴结核病，肺外结核和HIV/结核联合感染，糖尿病合并结核病患者，以及结核病公共突发事件具有重要应用价值，且对操作者的技能和实验室设备的要求也较低，适宜在基层医院开展。

[参考文献]

[1]刘萍萍，钟耐容，林伟斌，等.不同取痰方式结核杆菌痰涂阳性率及其影响因素研究[J].现代医院，2016，16（7）：999-1000.

[2]郑团圆，王士列，沈小平，等.新型隐球菌性脑膜炎与结核性脑膜炎的临床差异研究[J].中国当代医药，2014，21（30）：50-52.

[3]高孟秋，刘菲，纪滨英，等.两种γ-干扰素释放分析在结核病临床诊断中的比较研究[J].中华结核和呼吸杂志，2012， 35（10）：762-765.

[4]宋其生，陈秀琴，赵琴，等.结核菌素纯蛋白衍生物试验净增值与γ-干扰素释放试验在结核病群体感染中的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志，2012，35（9）：669-672.

[5]王旭洲，谢飞来，许文静，等.EDTA修复肉芽肿组织中荧光定量PCR检测结核杆菌的应用[J].临床与实验病理学杂志，2016，32（6）：665-668.

[6]许蕴怡，蔡杏珊，刘燕文，等.PCR线性杂交酶显色法与BD960液体法在耐多药结核杆菌药敏结果的对比分析[J].现代医院，2016，16（4）：529-531.

[7]董忠谊，钟文昭.克隆源性肿瘤新抗原诱导T细胞免疫反应增强免疫检查点抑制剂疗效[J].循证医学，2016，16（2）：67，69.

[8]王洁玲，唐余燕，张毅，等.结核分枝杆菌抗原Ag85B优势诱导活动性结核患者Th1型细胞免疫反应研究[J].医学研究杂志，2016，45（3）：77-82.

[9]刘晓慧，吴桂花，苏慧婷.侵袭性肺曲霉菌病感染早期特异性T细胞免疫反应的变化及意义[J].中国医师进修杂志，2015，38（11）：799-802.

[10]雷静，李奕恒，刘旭昭，等.动物源Ⅰ型胶原蛋白可引起BALB/c小鼠细胞免疫反应和组织免疫毒性[J].中国组织工程研究，2015，19（34）：5506-5512.

[11]谭遥，陈婷，李亚伟，等.新疆维、汉族鼻咽癌患者LMP2A特异性T细胞免疫反应差异性研究[J].新疆医科大学学报，2015，38（1）：1-5.

[12]任皎，赵莉，张卉，等.人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应[J].生物技术通讯，2014，25（4）：474-478.

[13]邓中华，谢志萍，姚立红，等.人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，2013，27（2）：141-143.

[14]赵煜，张涛，谭勇，等.IL-15对树突状细胞激活的T淋巴细胞免疫反应的作用观察[J].中国肿瘤临床，2013，40（3）：127-130.

[15]吕盈盈，王江蓉，廖晶，等.HIV/HCV共感染合并血友病患者利巴韦林联合干扰素治疗前后特异性细胞免疫反应的研究[J].临床内科杂志，2011，28（12）：827-830.

[16]陈瑾，吴金明，林贤凡，等.HBeAg特异性细胞免疫反应体外抗乙肝病毒作用[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010， 19（4）：313-316.

[17]陈雪林，邢俊蓬，刘佳文，等.结核杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的临床试验[J].临床肺科杂志，2015，20（9）：1580-1583.