爬地柏枯梢病病原菌鉴定1)

陈洁 祝文博 苏越 郑妍婕 刘雪峰

(东北林业大学，哈尔滨，150000)



爬地柏枯梢病病原菌鉴定1)

陈洁 祝文博 苏越 郑妍婕 刘雪峰

(东北林业大学，哈尔滨，150000)

在黑龙江省内采集病植物标本，对爬地柏枯梢病病原菌进行形态学和分子生物学鉴定。根据形态学初步鉴定爬地柏枯梢病病原物为微色二孢属(Microdiplodiasp.)。通过对该病原菌rDNA进行PCR扩增和序列测定，得出该序列与GenBank中微色二孢属的同源性为99%。从爬地柏枯梢病症状、病原菌、病菌生物学特性和防治技术4个方面描述爬地柏枯梢病，为该病害的防治提供借鉴。

爬地柏；枯梢病；微色二孢属；症状

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：68-70.

Sabinadavurica(Pall.) Ant. Shoot Blight Pathogen in Heilongjiang Province was identified asMicrodiplodiasp. based on morphological characteristics and ITS sequence analysis. By the rDNA PCR amplification and sequencing, the pathogen was 99% identity withMicrodiplodiasp. sequence from GenBank. We studied the symptoms of the disease, pathogens, biological characteristics of bacteria and control to introduceS.davuricaShoot Blight.

爬地柏(Sabinadavurica(Pall.) Ant.)又名兴安圆柏，为柏科圆柏属的一种，喜光，也比较耐荫，生于多石山地或山峰岩缝处，产于黑龙江大兴安岭海拔400～1 400 m地带，匍匐灌木，为常绿树种，其部分枝条斜立而显得姿态优美，比较有气势，而且具有寿命长、耐修剪、适应性强等特点，是园林绿化、水土保持及防沙治沙的优势品种。20世纪七八十年代黑龙江省防护林研究所引进了该树种，它生长良好，表现了极强的适应性，但长期以来未引起重视和开发利用。近几年由于生态建设、治沙及园林绿化的需要才逐渐引起关注，但在黑龙江省发现了一种新的病害，即爬地柏枯梢病，该病已经表现出现蔓延的趋势，有关其病原学的研究对病害虫防治有重要意义。

目前，关于爬地柏枯梢病病原以及防治技术的研究在国内还未见报道。爬地柏常见的病虫害，包括梨桧柏锈病、苹果锈病、茎叶腐烂型立枯病、小地老虎和蛴螬等[1]。有资料表明圆柏枯梢病(Diplodiapinea)在呼和浩特地区一些苗圃发生严重，发病率为82%，影响了圆柏的绿化效果，同时也给生产单位造成很大的经济损失[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年先后从黑龙江省中医药大学校园花坛采集50株，双鸭山市农垦红星隆管理局苗圃50株，齐齐哈尔市动植物园采集20株病叶、病枝标本，作为爬地柏枯梢病形态学分离和鉴定材料。

1.2 方法

1.2.1 症状观察

观察植株的危害部位及危害症状。取爬地柏枯梢病发病枝干，借助手持扩大镜或实体解剖镜观察病症特征，确认是否有病原菌的繁殖体或营养体。

1.2.2 病原菌分离培养

按发病部位分类(枝、叶)分别切取各部分3～5 mm，先用75%酒精消毒2～3 s，再用石灰水消毒1～2 min之后，用无菌水洗3～4遍。在超净工作台下，接种于PDA平板培养基，放入培养箱中25 ℃恒温培养。将不同的菌落分离纯化到平板上，放入培养箱中28 ℃培养。观察各种子实体的形态特征，了解植物上可能引起不同病害的病原。

采用单胞分离法对材料上的分生孢子器进行挑取单胞，放在PDA平板培养基上，培养箱中28 ℃培养。分离纯化后得到纯菌落，挑取菌丝于斜面培养基上培养获得病原菌纯菌落并保存。

1.2.3 致病性测定

按照柯赫氏法则，采用有伤和无伤接种方法对健康的爬地柏叶和梢接种，对其分离物进行致病性测定。

从阿城区玉泉龙达苗圃购买的健康爬地柏种苗。利用纯菌种配制孢子悬浮液(数量大致为100×镜视野下200个)。涂抹于针叶(50株)和梢(50株)上进行伤口(无菌针刺伤)和无伤口接种，并设对照实验组。接种后套袋用湿纱布保湿48 h，以套袋保湿不接种为对照。常温条件下观察发病症状变化及发病率。

1.2.4 病原菌再分离

从已经发病的植株上，分离培养病原菌，进行分离、纯化。徒手切片，用水作承载剂镜检病害标本的分生孢子器、分生孢子等形态特征、大小、颜色等，与最初的接种分离物进行比较。

1.2.5 病原菌形态鉴定

取新鲜发病叶片，在实体显微镜下切取分生孢子器，徒手切片，用水作承载剂制成简易玻片标本，然后在显微镜下观察病原菌的分生孢子器、分生孢子、分生孢子梗的形态，利用电子显微镜拍摄照片，并用工具测量其大小。

将病原菌接种于PDA上进行培养，观察其形态特征。

①生长速率：在28 ℃条件下察观各阶段生长形态变化。

②孢子形态：8 d左右在显微镜下观察其分生孢子器，产孢细胞，孢子大小，并照相记录其形态。

1.2.6 病原菌分子鉴定

用真菌的通用引物ITS1/ITS4对病原菌进行PCR扩增，对获得的扩增产物进行测序，将得到的序列进行对比，通过同源性分析对病原菌进行分子水平鉴定。

①DNA的提取：采用冷冻液氮研磨CTAB法提取病原菌DNA[3]。

②PCR扩增：使用的引物是核糖体ITS区段通用序列ITS1(5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCGCTTATT-GATATGC-3′)，进行20 μL体系扩增后，再做琼脂糖凝胶电泳检测。

③DNA测序：将PCR产物送入上海生工测序公司测序。

④测序与对比：将PCR测序获得的DNA序列与NCBI数据库进行序列对比分析，做病原菌的同源性分析，并与形态学鉴定相结合确定病原菌分类地位。

2 结果与分析

2.1 爬地柏枯梢病症状

爬地柏的叶、枝均受此病害的危害。针叶受害时，初期梢部针叶从叶尖向叶基逐渐变黄枯死，出现埋生的小黑点；后期枯死的针叶呈黄棕色，枯梢向下蔓延，直立不脱落。病叶上形成半埋生的表面光滑球状小黑点，枯死枯枝成灰褐色。枝干部受害时逐渐褪绿，由淡褐色变为褐色，最后变为灰褐色。病枝上形成半埋生的表面光滑球状小黑点，即病菌的分生孢子器。受害感病植株易产生倒伏现象(见图1)。

图1 爬地柏枯梢病病害症状

2.2 病原菌形态特征

暗处的条件下在PDA培养基上培养3～5 d后接种点长出白色绒毛状菌落，呈圆形，边缘整齐，长满培养皿。未见色素产生情况，未见分生孢子器。自然光培养5～8 d逐渐在白色菌落背面产生呈灰色同心圆的波纹，菌落背面波纹从中央依次向边缘加深，边缘颜色最深。8～10 d后逐渐变为黑色，菌落正面边缘长出的黑色表面光滑小点为病原菌的分生孢子器。

分生孢子器球形，单生，初埋生后外露，呈半埋生于表皮下，有孔口。分生孢子器外壁是暗色的，内壁是无色的。内壁上连接有无色的分生孢子梗，分生孢子梗形式为全壁芽生单生式。分生孢子初期无色单胞，中期淡色双胞，横隔逐渐变宽，颜色加深。成熟后为淡褐色双胞、椭圆形或卵形，横隔颜色深于孢子壁颜色。尺寸为(16.0～22.5)μm×(8.5～13.0)μm，平均19.35 μm×9.90 μm。标本号：MD.01。

a.分生孢子器；b.分生孢子器横截面；c.分生孢子梗及产孢方式；d.分生孢子；e.菌落正反面宏观形态特征；标尺=10 μm。

图2 微色二孢(Microdiplodiasp.)

2.3 致病性测定结果

用从红星隆管理局苗圃采集到的病梢组织中分离得到菌株01接种健康植株。48 h后进行拆袋症状观察，接种7～10 d后，伤口接种的枝和叶有38株和40株有感病情况，无伤口接种枝叶共3株有感病情况，对照组均无感病情况。21 d左右感染了伤口接种组内接种部位及接种的整株植株，并可见黑色半埋生的分生孢子器。伤口接种病害发病率78%～80%。

2.4 病原物分子生物学测定

根据DNA测序结果与NCBI数据库数据对比，得出病原菌分类地位与Microdiplodiasp.(登记号：KF010841.1)的相似度为99%，病原菌分类地位与Diplodiapinea(登记号：JHUM01000052.1)的相似度为94%。同时该病原菌DNA测序结果已提交NCBI数据库(登记号：KX034227.1)。

3 结论与讨论

从哈尔滨市中医药大学、双鸭山市农垦红星隆管理局、齐齐哈尔市动植物园采集大量发病的病叶、病枝，经过对其分离、纯化，根据菌落生长速度、菌落形态、色素产生情况、孢子及分生孢子器的基本形态相似度和分子鉴定，得出该菌种序列与Microdiplodiasp.相似度为99%，而与Diplodiapinea相似度仅为94%，共同确定爬地柏枯梢病的病原为Microdiplodiasp.微色二孢属。

色二孢属与微色二孢属病症基本相同，都是变黄枯死，在发病部位产生半埋生的小黑点。成熟分生孢子均为淡褐色双胞，但分生孢子成熟过程稍有差别，色二孢属孢子成熟后产生横隔，微色二孢属孢子未成熟就产生横隔。

已有资料表示1969年10月在Gulab Gardens的荔枝上发现一种严重的叶部病害，叶部受害处从黄褐色至砖红色，出现黑色点状物体。在真菌学文献中，该属种已被描述并认为是不同的，考虑其宿主特异性的，被命名为Microdiplodialitchi.。2005年8月W. Gams & Y. Degawa，在Sophorachrysophylla上发现并命名为MicrodiplodiaAllesch.[4]。针对这微色二孢属国内外研究过少，需要我们进一步研究讨论。

[1] 兰丽萍.园林绿化树种圆柏的病虫害防治[J].中国园艺文摘,2013(4):97-98.

[2] 袁秀英,韩艳洁.圆柏枯梢病病原菌的研究[J].内蒙古林学院学报(自然科学版),1997,12(4):37-40.

[3] 庄彩云,李潞滨,胡陶,等.适用于rDNA的ITS分析的兰属菌根真菌培养及DNA提取方法[J].北京农学院学报,2007,22(3):4-6.

[4] CROUS P W. Groenewald Johannes Z.MicrodiplodiahawaiiensisCrous, sp. nov.[EB/OL]. Fungal Planet, 2006:7(2006-08-20)[2016-10-31].(http://www.fungalplanet.org/content/descriptions/descriptions_001.htm).

Identification ofSabinadavurica(Pall.) Ant. Shoot Blight Pathogens Human

Chen Jie, Zhu Wenbo, Su Yue, Zheng Yanjie, Liu Xuefeng

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

Sabinadavurica(Pall.) Ant.； Shoot blight；Microdiplodiasp.； Symptom

1)国家级大学生创新训练项目。

陈洁，女，1994年8月生，东北林业大学林学院，本科生。E-mail：1256985001@qq.com。

刘雪峰，东北林业大学林学院，研究员。E-mail：757489401@qq.com。

2016年3月16日。

S763.15

责任编辑：戴芳天。